癌相关成纤维细胞来源外泌体递送miR-196a-3p促进鼻咽癌侵袭和转移的分子机制研究

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) play an important role in tumor metastasis, but the role and molecular mechanisms of CAFs in the metastasis of nasopharyngeal carcinoma are still unclear. Our previous study found that the expression level of CAFs in cancer tissues was related to the distant metastasis of NPC patients. Primary cultured CAFs confirmed the existence of exosomes in the conditioned medium, which could promote the invasion of NPC cells. miRNA-196a-3p was selected as the key molecule for the delivery of CAFs exosomes by miRNA microarray. miRNA-196a-3p was significantly up-regulated in CAFs exosomes and nasopharyngeal carcinoma cells stimulated by CAFs exosomes. Bioinformatics analysis showed that the potential target is EPAS1. Therefore, we propose the hypothesis that CAFs exosomes deliver miR-196a-3p, a potential target for EPAS1 in nasopharyngeal carcinoma cells, thereby promoting invasion and metastasis of this cell. We intend to explore the role and molecular mechanism of CAFs exosome delivery miR-196a-3p in the regulation of invasion and metastasis of nasopharyngeal carcinoma from the aspects of cell, animal model and clinic, and provide new clues for the prevention and treatment of NPC metastasis.

癌相关成纤维细胞（CAFs）在肿瘤转移中起着重要作用，但CAFs在鼻咽癌转移中的作用及分子机制尚不明确。我们前期发现：癌组织中CAFs的含量与鼻咽癌患者远处转移相关，原代培养CAFs条件培养上清中存在外泌体，该外泌体可促进鼻咽癌细胞侵袭。miRNA芯片筛选到miRNA-196a-3p可能为CAFs外泌体递送的关键分子，qRT-PCR发现CAFs外泌体及其刺激的鼻咽癌细胞中miRNA-196a-3p显著上调，生物信息分析发现其潜在靶点为EPAS1。因此，我们提出CAFs外泌体递送miR-196a-3p，后者作用于鼻咽癌细胞中的潜在靶点EPAS1，从而促进该细胞侵袭转移的假说。我们拟从细胞、转移动物模型、临床三个层面探讨CAFs外泌体递送miR-196a-3p调控鼻咽癌侵袭转移的作用及分子机制，为鼻咽癌转移的防治提供新的线索。

鼻咽癌（NPC）是我国南方地区高发的头颈部恶性肿瘤，有较高的转移潜能。癌相关成纤维细胞（CAF）在肿瘤转移中起着重要作用，但CAF在鼻咽癌转移中的作用及分子机制尚不明确。课题组前期研究发现：癌组织中CAF的含量与鼻咽癌患者远处转移相关。进一步预后研究发现：α-SMA与肿瘤相关巨噬细胞指标CD163共同构建的预后模型可较好预测患者无远处转移生存；构建的血清炎性指标模型也可较好预测鼻咽癌患者的预后。我们通过收集鼻咽癌及对应癌旁新鲜组织标本，分离并原代培养CAF和正常成纤维细胞（NF）细胞；原代培养CAF条件培养上清中存在外泌体，该外泌体可促进鼻咽癌细胞迁移与侵袭。在此基础上，我们选取了5对CAF和NF, 对其上清中分离得到的外泌体进行miRNAs测序，其中miRNA-148a-3p与鼻咽癌患者无远处转移预后密切相关，进而采用qRT-PCR方法检测CAF或NF外泌体刺激的鼻咽癌细胞中miRNA-148a-3p的表达情况，结果显示CAF外泌体刺激的鼻咽癌细胞中miRNA-148a-3p的表达显著低于NF外泌体处理的鼻咽癌细胞；为进一步研究，我们将不同表达水平miR-148a-3p的CAF分别共培养鼻咽癌细胞，Transwell试验结果显示，与对照组相比，过表达miR-148a-3p的CAF共培养后的NPC细胞显著抑制NPC细胞的迁移和侵袭能力；我们进一步采用生物信息的方法预测出其下游潜在靶点为TGIF2。Western Blot和qRT-PCR方法不同表达水平miR-148a-3p的CAF共培养的鼻咽癌细胞株中检测TGIF2在表达情况，结果显示高表达miR-148a-3p的CAF共培养的NPC细胞中TGIF2的表达显著低于低表达miR-148a-3p的CAF处理的NPC细胞。敲低miR-148a-3p后，我们发现TGF-β信号通路启动子的荧光素酶活性与对照组相比下降。Western blot结果显示，过表达miR-148a-3p后，鼻咽癌S18细胞株中的EMT指标，Vimentin、Snail 的表达水平显著降低。鼻咽癌肺转转移动物模型结果显示miR-148a-3p的下游靶基因TGIF2可显著促进鼻咽癌细胞转移的发生。综上，本课题研究为鼻咽癌远处转移防治提供了潜在新的方向以及靶点：miR-148a-3p，具有潜在的临床应用价值。