长链非编码RNA在人骨髓间充质干细胞成骨分化中的表达及分子机制研究

In recent years, the application research of bone tissue engineering in the patients with maxillofacial tissue defect in constant development, how to build an ideal bone graft has become a research hotspot.Therefore, the seed cells of the most widely used in bone tissue engineering-human bone marrow mesenchymal stemcells (hMSCs) has become the key research object.And recent studies have found a new regulatory mechanism outside of DNA sequence,the long non-coding RNA (lncRNA) also affect the osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells,but few studies reported at present.We have passed through the lncRNA chip preliminary screening differentially expressed lncRNA during the osteogenic differentiation of hMSCs.So the project is proposed on the basis of previous studies to increase sample size and use lncRNA chip to screening differentially expressed lncRNA of more representative related osteogenic differentiation of hMSCs.Then we selected parts of lncRNA to identify the molecular function.At last we study on its molecular mechanism through bioinformatics, RNomics and proteomics.To clarify the specificity lncRNA has play an important role during the osteogenesis of hMSCs and its molecular mechanism,it provides new ideas and targets for the research of bone tissue engineering.

近年来,骨组织工程在患者颌面部骨组织缺损修复中的应用研究在不断的发展深入，如何构建理想的组织工程骨移植物成为了研究热点。因此，骨组织工程中应用最广泛的种子细胞—人骨髓间充质干细胞（hMSCs）自然成为了重点研究对象。而最近有研究发现一种新的DNA序列以外的调控机制即长链非编码RNA（lncRNA）影响间充质干细胞的成骨分化,但目前鲜有研究报道。而且我们前期已通过lncRNA芯片初步筛选出在hMSCs成骨分化过程中差异表达的lncRNA。因此本项目拟在前期研究的基础上增加样本量后通过lncRNA芯片筛选出与hMSCs成骨分化相关的更具代表性的差异表达lncRNA，并选取部分lncRNA进行分子功能鉴定，最后利用生物信息学、RNA组学及蛋白质组学等技术，对其分子机制进行研究。阐明在hMSCs成骨分化中发挥重要作用的特异性lncRNA及其分子机制，进而为今后的骨组织工程研究提供新的思路及靶点。

随着人类基因组内越来越多的长链非编码RNA（lncRNA）被鉴定出来，人们发现lncRNA所介导的复杂网络在细胞和组织分化过程中发挥重要作用。但是目前，对于lncRNA在人骨髓间充质干细胞（hMSCs）成骨分化中的调控机制研究尚未系统开展。因此本项目主要探讨hMSCs成骨分化过程中发挥重要功能的lncRNA，预测其可能作用的靶基因及其分子机制。我们首先通过高通量lncRNA芯片筛选出hMSCs成骨分化前后发生差异表达的lncRNA。结果发现与成骨诱导分化前相比，成骨诱导分化过程中持续表达上调超过2倍的lncRNA有433条，下调超过2倍的lncRNA有232条。我们随机选取5个持续差异表达的lncRNA进行Real-time PCR验证，结果与芯片检测结果一致。选取持续表达上调较大的lncRNA ENST000005855 37.1及下调较大的lncRNA eHIT00001595进行生物信息学分析预测其可能作用的靶基因。选取差异表达较大的lncRNA ENST00000502125.2进行功能验证，结果发现lncRNA ENST0000050 2125.2有抑制hMSCs成骨分化的作用。我们进一步通过lncRNA高通量测序实验对hMSCs成骨分化前后发生差异表达的已知和未知lncRNA进行筛选，结果显示与成骨诱导分化前相比，成骨诱导分化7天后发生差异表达的已知lncRNA有7条，其中2条表达上调，5条表达下调；发生差异表达的未知lncRNA有57条，其中35条表达上调，22条表达下调。我们随机选取12条差异表达的lncRNA进行Real-time PCR验证，结果显示与测序检测结果一致。接着选取4条差异表达lncRNA与mRNA进行相关性分析，对其作用的靶基因进行预测。然后选取lncRNA-1708进行功能验证，结果发现lncRNA-1708有抑制hMSC成骨分化的作用。后续我们将继续对在人骨髓间充质干细胞成骨分化过程中发挥重要作用的lncRNA进行体内外功能验证，并对涉及的生物学通路及分子机制进行预测和验证，这将进一步揭示 lncRNA 在 hMSCs 成骨分化中的作用及其生物学功能,将从一个全新的角度诠释及理解 hMSCs 定向成骨分化的分子机制,进而为今后的骨组织工程研究提供新的思路及靶点。