直翅目昆虫的比较及进化线粒体转录组学研究

采用基于454高通量测序技术的深度转录组测序方法和 RT-PCR实验验证方法，构建已知线粒体基因组序列的6种直翅目昆虫线粒体基因组转录图谱，获得线粒体初级转录本、成熟转录本和转录剪接中间产物的信息，据此研究直翅目昆虫线粒体转录组特征、转录变异及转录调控特征的进化，并解决直翅目昆虫线粒体基因组注释过程存在的多顺反子转录单位的数目、起始与终止部位，部分蛋白质基因的起始密码子和终止密码子，lrRNA和srRNA的起始与终止位置等问题；同时，从6种昆虫的核转录组数据聚类获得的单位基因序列数据中，进行直翅目昆虫的谱系基因组学研究，构建建立稳健的直翅目2亚目4总科之间的系统发育关系。本项目是首次对昆虫纲一个目的主要代表类群的线粒体基因组进行详细的转录组的比较及进化研究，项目研究成果在线粒体基因组、转录组和谱系基因组学等领域具有重要意义。

线粒体基因组被广泛应用于进化生物学研究中，然而采用生物信息学方法注释线粒体基因组存在许多问题。基因组注释中遇到的这些问题都必须通过实验的方法解决，其中最直接的方法就是线粒体转录本作图。本项目完成了中华稻蝗、中华蚱蜢、短额负蝗、东方蝼蛄、黄脸油葫芦和黑胫钩额螽成虫和3-4龄若虫转录组的测定和分析，并对其中的线粒体转录本进行了系统地分析，获得的主要结果如下：1. 确定了线粒体初级转录本和转录起始位置：通过对6种直翅目昆虫全线粒体转录物作图发现线粒体基因组有5个大的初级转录单元，初级转录本对线粒体基因组的覆盖度很高（平均95%左右）。J链有2个转录起点，N链有3个转录起点。2. 线粒体基因组各基因的边界确定：线粒体转录本可以拼接出44个mtUnigene，其中有9个覆盖到基因边界区域。两对重叠基因ATP8/ATP6和ND4/ND4L分别存在一个转录本中；COX3基因、tRNA-Gly和ND3基因存在于一个转录本中；ND1和tRNA-Ser基因存在于一个转录单位中；COX1基因的起始密码子为非常规的；ND2、COX1、COX2、ND5的不完全终止密码子可能在tRNA加工过程中由多聚腺苷酸加尾过程完善。3. 线粒体基因组各个基因的相对表达量：在线粒体基因组中，所有物种的rRNA基因的转录效率高于蛋白编码基因，13种蛋白编码基因存在异质性表达。蛋白编码基因中，COI 在雌、雄成虫中的表达水平均是最高的，其次是COX3、ATP6、CYTB、COX2等，ND5、ATP8、ND1、ND4L、ND6等基因reads覆盖度最低。13个蛋白质编码基因中，编码在J链上的基因往往具有较高的覆盖度，而N链编码的基因覆盖度较低。4. 直翅目昆虫雌雄成虫线粒体转录组的比较：直翅目昆虫的雌、雄成虫线粒体基因组的表达模式及表达量变化趋势在整体上是一致的，但雌性成虫线粒体转录活动明显高于雄性成虫线粒体转录活动。5. 直翅目昆虫雌雄成虫和若虫线粒体转录组的比较：直翅目昆虫的的若虫和雌性或雄性成虫的线粒体蛋白编码基因和核糖体RNA基因转录表达模式基本一致，但若虫线粒体转录活动明显高于雌雄性成虫。