外源性HCV RDRP对宿主细胞的表观遗传调控及在肝癌发病中的作用

Endogeneous RDRP plays an important role in RNA-directed gene silencing and DNA methylation in plants and C.elegans.In human cells,siRNA can only cause the formation of heterochromatin on its target sites without detectable DNA methylation.Comparing components of RITS and RISC complexes reveals that there is no convincible evidence which shows that human cells do exist endogenous RDRP. So is there any possibility that exogenous HCV NS5B, in addition to participate in HCV genome replication, has any other function like modifying the epigenetic status of host human cells? In our research project,HCV RDRP with high activity will be transfected to human cells to find out how the exogenous RDRP tunes the epigenetic modifications of host cells. The components of the RDRP complex will be determined by TAP and mass-spectrometry;The target sites of hepatoma-specific miRNA in the promoter of tumor suppressor gene will be identified and the function of RDRP in the tumor suppressor gene silencing will be verified. Conclusions from this project will contribute to answer two fundamental scientific questions:(1)The mechanism by which siRNA rarely induces DNA mathylation in mammalian cells;(2)Role of exogenous HCV RDRP played in pathogenesis of HCC, and shed new light on HCC prevention and treatment.

细胞内源性的RDRP在植物及线虫中RNA介导的基因沉默和DNA甲基化中发挥重要作用。在人类细胞中siRNA仅能引起靶位点异染色质形成，难于导致DNA甲基化。RITS和RISC复合物组分比较发现人类细胞不存在确定性的RDRP。丙肝病毒RDRP在感染宿主细胞后除复制自身的基因组外，能否替代内源性的RDRP对宿主细胞的表观遗传学修饰状态产生影响呢？本项目通过将高活性HCV RDRP导入宿主细胞后，研究外源性HCV RDRP对宿主细胞表观遗传学修饰的影响；利用TAP和质谱技术解析RDRP复合物组分，探讨其作用机制；生物信息学分析寻找肝癌特异性miRNA在肿瘤抑制基因启动子区域靶位点，验证RDRP在肝癌肿瘤抑制基因沉默中的作用。本项目研究有助于回答两个重要科学问题：（1）siRNA在哺乳动物细胞中难于引起DNA甲基化的分子机制；（2）HCV RDRP在肝癌发病的作用，为肝癌治疗和预防提供新的思路

RNAi现象在植物和线虫中已被证实具有RNA导向的DNA甲基化（RNA Directed DNA Methylation, RDM ），然而在哺乳动物中的相关调控机制却一直存在争议。丙型肝炎病毒很少进入宿主基因组，但其导致的肝癌发生率却远高于其他类型的肝癌，相关发病机制尚不清楚。以上两个问题一直是困扰表观遗传学领域和肝癌研究领域的两个重要问题。本项目以外源性HCV RDRP为切入点，结合RDRP 在植物和线虫中对表观遗传学的影响，研究RDRP与肝癌表观遗传学异常的关系。 . 通过构建高活性的HCV RDRP，并导入宿主细胞293T中，以研究哺乳动物细胞中HCV RDRP对 siRNA干扰效应的影响，以及HCV RDRP对宿主细胞siRNA靶向序列的DNA甲基化影响。经过系列研究和验证，我们发现HCV RDRP能够通过初级siRNA产生次级siRNA，进而对siRNA的干扰效果起到放大作用。更重要的是，我们发现HCV RDRP能够诱导siRNA靶向位点的DNA序列发生甲基化修饰。本研究初次发现在哺乳动物细胞中表达HCV RDRP能够引起宿主细胞DNA发生甲基化修饰这一现象，如果合理地将这一系统进行改进和优化，将有可能通过HCV RDRP实现DNA的定点甲基化，填补DNA定点甲基化的空白，应用前景良好。此外，本项目的研究结果也将有助于阐明HCV RDRP诱导宿主细胞表观遗传学异常的相关机理，为阻断肝炎肝癌转变提供了新策略。. 目前，本项目已经取得了丰富的研究成果，已发表2篇SCI论著，成功申报了一项关于“全基因组DNA甲基化的导向测序技术”的专利和一项关于“小RNA定量检测技术”的专利，且在本项目执行期间成功培养了3名博士研究生和1名硕士研究生，圆满完成了本项目的相关要求。