通过重构胞内氧化还原反应平衡路径选择性强化乙偶姻和2,3-丁二醇合成效率的分子机制

Acetoin and 2,3-butanediol (2,3-BD) are bio-based important platform chemicals due to their wide industrial applications in chemical, food, and fuel, and other fields. It was reported that 2,3-BD could be reversely transformed to acetoin and it was difficult to selectively produce acetoin and 2,3-BD by a strain. Based on this finding, in this work, we will aim to engineer a Bacillus amyloliquefaciens through reconstruction the oxidation-reduction cycle to selectively produce acetoin and 2,3-BD. we have a wealth of experience in enzyme expression and cofactor metabolic engineering. Firstly, we will try to enhance the flux of pentose phosphate pathway to improve the pyruvic acid production and change the oxidation-reduction cycle. Then, redistribution the carbon flux to 2,3-BD pathway by manipulating AlsR expression level. Subsequently, acetoin production can be selectively enhanced by reconstruction of NADH/NAD+ regeneration cycle. Finally, 2,3-BD production can be selectively enhanced by change the cofactor preference to reconstruct the oxidation-reduction cycle.

乙偶姻和2,3-丁二醇是重要的生物基平台化合物，广泛应用于化工、食品等多个领域。但是，难以实现在一个菌株中选择性高产乙偶姻或2,3-丁二醇。本项目拟通过重构胞内氧化还原反应平衡途径，获得一株具有选择性高效合成乙偶姻和2,3-丁二醇性能的菌株。申请人前期在关键酶表达调控、产物合成与辅酶循环再生相关性论证与分析方面做了大量的研究。本申请研究内容涵括四个方面：（1）通过强化磷酸戊糖通路，拓宽葡萄糖代谢路径同时扰动胞内氧化还原平衡路径；（2）通过优化调控因子AlsR表达水平，使更多的丙酮酸流向2,3-丁二醇路径；（3）乙偶姻合成无需辅因子，通过IPTG诱导启动子引入或强化其它氧化还原反应平衡路径，定向强化乙偶姻合成；（4）对2,3-丁二醇脱氢酶进行辅酶偏好性改造，通过温度诱导启动子重构胞内氧化还原反应平衡途径，选择性强化2,3-丁二醇合成。最终实现乙偶姻和2,3-丁二醇在微生物体内可控合成。

乙偶姻和2,3-丁二醇是重要的生物基平台化合物，广泛应用于化工、食品等多个领域。目前，乙偶姻和2,3-丁二醇的生产菌株主要有芽孢杆菌、粘质沙雷氏菌、克雷伯氏菌和肠杆菌等。微生物合成乙偶姻和2,3-丁二醇的主要生理功能是调控胞内氧化还原电势。本研究针对难以实现在一个菌株中选择性高产乙偶姻或2,3-丁二醇的问题，重构了枯草芽孢杆菌胞内的氧化还原反应平衡途径，主要研究结果包括：1）通过强化磷酸戊糖通路关键酶ZWF和GDH活性，拓宽葡萄糖代谢路径同时扰动胞内氧化还原平衡路径；2）通过调控转录调控因子ALsR的不同表达水平，促进了乙偶姻和2,3-丁二醇的高效合成；3）在胞内引入了可以利用辅酶NADPH的2,3-丁二醇脱氢酶（TDH），构建了新的辅酶再生系统，选择性提高了2,3-丁二醇的合成效率；4）利用Cre/loxP敲除体系敲除了乙偶姻降解相关基因（Rex编码基因ydiH）和bdhA等基因, 通过引入NOX重构胞内辅酶再生路径，选择性提高了乙偶姻的合成效率；进而实现了选择性高效合成乙偶姻和2,3-丁二醇的目标。同时，我们对乙偶姻和2,3-丁二醇另一生产菌株粘质沙雷氏菌研究时发现，温度对其次级代谢产物灵菌红素具有显著调控作用，我们以粘质沙雷氏菌JNB5-1为目标菌株，利用Tn5G转座子插入突变技术在其全基因组范围内构建了插入突变文库，发现并解析了调控因子RcsB、MetR、PsrA和Cpx对灵菌红素合成的调控机制，同时发现它们对乙偶姻和2,3-丁二醇的合成也具有一定的调控作用。