SCL慢病毒转染重塑膀胱ICC治疗DCP的实验研究

Diabetic cystopathy (DCP) is a complication of diabetes in urinary system. We previously demonstrated that high glucose can reduce the number of the interstitial cells of Cajal (ICC) in bladder and the pacing and signal-transducting function of ICC. The result was related to the decrease of detrusor function, resulting in DCP. We further demonstrated gene transfection of SCL can promote c-kit and restore redifferentiated ICC in vitro. So we want to investigate whether gene transfection of SCL can also restore redifferentiated ICC and detrusor function of DCP in vivo. At first, this study is designed to assess the efficiency and safety of SCL gene lentiviral vector after it constructed successfully. Then , we will fill SCL gene lentiviral vector into bladders of the DCP animal models through urethras. Bladder function will be tested by urodynamic and accessed by contraction of detrusor strips. Phenotype and function of ICC will further tested by immunohistochemistry , cell patch clamp, RT-PCR、Western-blot and other assays.

糖尿病膀胱病变（DCP）是糖尿病引起的泌尿系统并发症之一，我们前期研究证实高糖环境可引起膀胱Cajal 间质细胞(ICC)数量减少,形态改变，起搏和神经信号传导功能降低，进而引起膀胱逼尿肌兴奋和收缩功能下降，导致DCP，而通过构建SCL基因重组腺病毒载体，采用 SCL基因转染上调c-kit，显著改善了体外高糖环境下培养的已受损害的ICC形态和功能。为了观察经膀胱灌注进行SCL基因转染对在体DCP膀胱中 ICC表型、形态、功能损害的重塑作用及治疗DCP的可行性及有效性，本研究拟构建SCL基因重组慢病毒载体，评估慢病毒载体的体外转染效率及安全性后，经尿道将SCL基因慢病毒载体灌注入DCP膀胱，通过尿流动力学和肌条实验检测膀胱功能恢复情况，并进一步通过免疫组化、细胞膜片钳、电镜、RT-PCR、Western-blot等技术观察ICC表型及形态、功能重塑情况，从而为DCP的临床治疗探索一条新途径。

DCP将引起膀胱起搏细胞-Cajal细胞功能受损，造成逼尿肌收缩障碍，从而引发膀胱敏感性降低、容积增大、顺应性增强。膀胱ICC 细胞膜酪氨酸蛋白激酶受体—c-kit 蛋白表达下降可能是体内外高糖环境引起ICC 数量、形态及功能改变的主要原因。c-kit 基因转录调控区存在干细胞白血病基因(SCL)结合位点，SCL 主要是通过作用于c-kit 基因启动子调节c-kit 表达来发挥其“生存基因”的功能。本课题组为实现对DCP的基因靶向治疗，构建了SCL基因重组慢病毒，并成功转染体外分离培养的ICC样细胞，在MOI=10，转染后第72小时转染效率最高、生物活性最高、安全性最高，转染效率达85%。在体研究发现，滴度为 4×108TU/ml 的慢病毒50μl 量时膀胱组织肌层有强绿色荧光分布，说明SCL基因重组慢病毒可有效转染豚鼠膀胱。课题组通过构建豚鼠糖尿病膀胱病变模型，并经尿道行膀胱干细胞白血病基因慢病毒灌注，研究发现2d 后，膀胱组织未见明显绿色荧光，SCL 基因 RNA 水平轻度增高；7d、14d 后，组织全层可见明显绿色荧光，SCL 表达明显增高；28d后，可见较淡绿色荧光持续存在，且 SCL 水平仍高于正常水平。结果说明SCL可经尿道成功转染DCP膀胱，并稳定表达。通过继续构建模型，灌注慢病毒后分别于2d、7d、14d、28d对DCP进行研究，并在不同水平观察治疗效果：（1）形态方面：随着转染时间的延长，共聚焦显微镜下发现ICC数量逐渐增多，分布逐渐密集，绿色荧光逐渐减弱；透射电镜观察到ICC的细胞器数量增多、形态趋于正常、细胞内空泡减少、胞周突起延长变多，受损的ICC的超微结构在不断的恢复。（2）功能方面：单个受损的ICC细胞电流幅度逐步增高，14d达到峰值350.0±29.9pA；细胞内“钙超载”的到改善；膀胱组织c-kit mRNA和蛋白的表达得到显著上调；膀胱肌条收缩性、兴奋性逐步提高；尿动力学更加从膀胱整体水平证实豚鼠膀胱容量，残余尿量明显降低，最大逼尿肌压、膀胱顺应性显著增加。以上研究结果证实，膀胱灌注SCL基因重组慢病毒载体可上调c-kit的表达，逆转和重塑ICC 表型、形态及功能，促进DCP 膀胱功能恢复，为DCP临床治疗提供了新的思路。