中性粒细胞调控角膜神经损伤再生的作用及机制研究

The cornea is one of the most innervated tissue of human body. The dense corneal innervation maintains the integrity and function of cornea. Corneal nerve has the capability of regeneration after injury. However, the cellular and molecular mechanisms underlying corneal re-innervation remain elusive. In our previous study, we found that depletion of neutrophils significantly retard corneal re-innervation. Blocking of SP-NK1R signaling pathway (SP knock out or NK1R antagonist) could delay corneal nerve regeneration. SP knock out or NK1R antagonist suppress the infiltration of neutrophils into cornea post injury. Based on the above findings, here we will explore the mechanisms of neutrophils and SP-NK1R signaling pathway in the corneal re-innervation, by using mouse corneal nerve injury model and in vitro co-culture model. Using gene expression profiling, mass spectrometry, Western blot and quantitative PCR: (1) Finding the regulation and intervention roles of neutrophils in the regeneration of corneal nerve injury; (2) Finding the key target factor and downstream signaling pathway of neutrophil-mediated corneal regeneration in SP-NK1R signaling pathway. The purpose of this study is to enrich the knowledge of corneal wound healing and provide novel targets and intervention therapy for the neurotrophic keratopathy.

角膜丰富的神经末梢对维持角膜的结构完整与正常功能具有重要作用。角膜神经损伤后具有较强的再生能力，但其损伤再生的机制尚不明确。项目组前期研究发现：中性粒细胞清除可显著延迟损伤的角膜神经修复再生；阻断SP-NK1R信号通路(SP敲除小鼠和NK1R拮抗剂)可导致角膜损伤后中性粒细胞趋化数量下降及神经损伤再生延迟。在此基础上，本项目拟采用野生型小鼠和SP基因敲除小鼠，建立角膜神经末梢损伤的体内模型及体外细胞共培养模型，采用高通量测序检测、干扰RNA、质谱分析、Western blot与定量PCR等技术研究：(1)中性粒细胞在角膜神经损伤再生过程中的调控及干预作用；(2)中性粒细胞受SP-NK1R信号通路调控的介导角膜神经再生的关键靶基因及其下游信号通路。本项目深入探讨了SP-NK1R信号通路介导中性粒细胞调控角膜神经再生的重要分子机制，为角膜神经损伤修复相关疾病的治疗提供了新的策略和干预措施。

中性粒细胞是最早进入伤口的炎症细胞，是固有免疫的重要组成细胞，也是机体免疫防御的重要效应细胞。最近的研究发现中性粒细胞在创伤修复中也有积极的作用，这些积极的作用包括：通过吞噬作用、氧化抗菌效应和激活补体等方式清除坏死组织和异物，保护正常组织，防止感染的发生，为修复创造必要条件。另外中性粒细胞还可以分泌诸多重要的细胞因子，如白细胞介素-1（IL-1）、肿瘤坏死因子（TNF-α）、血管内皮生长因子（VEGF）、基质金属蛋白酶（MMPs）等，参与激活表皮细胞、成纤维细胞、血管内皮细胞，启动组织修复，在非细菌性组织损伤和慢性炎症中发挥重要的作用。.本项目主要工作：1）建立正常野生型小鼠和中性粒细胞清除（注射Ly6G中和抗体）小鼠模型，刮除角膜中央上皮及神经，发现中性粒细胞影响角膜神经损伤再生，通过RNA-seq筛选中性粒细胞参与角膜神经损伤再生的关键靶点因子，共筛选出546个差异表达基因，其中316个基因表达上调，230个基因表达下调。差异基因在细胞对化学刺激的反应、白细胞迁移、细胞趋化、细胞迁移 白细胞趋化作用、白细胞趋化作用中显著富集（BP）；在金属内肽酶活性、受体配体活性、受体调节剂活性、信号受体结合、 细胞因子活性中有重要作用（MF）；在细胞外区域、细胞外空间、细胞外区域部分、细胞表面、细胞外基质中显著富集（CC）。2）建立SP敲除小鼠以及NK1R拮抗剂处理的角膜神经损伤模型,结果显示角膜损伤后SP敲除小鼠角膜神经再生延迟，伴随中性粒细胞浸润减少。结合中性粒细胞清除RNA-seq结果分析，在对相关神经营养因子的检测中发现角膜基质中VEGF、NGF、GDNF和PEDF明显减少。基于上述结果本项目发现SP-NK1R信号通路可调节中性粒细胞的趋化及介导角膜神经损伤再生，这一过程主要是通过中性粒细胞分泌相关细胞因子实现的。