骨髓间充质干细胞来源的外泌体miR-125b-5p在新生鼠缺氧缺血脑损伤中的作用及机制研究

Neonatal hypoxic-ischemic encephalopathy (HIE) is a serious disease for neonates. It is important to explore its repair mechanism. The applicant, as the co-first author, reported that bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) play a neuroprotective role by activating autophagy in hypoxia-ischemia brain damage (HIBD) model. This study intends to further explore the molecular mechanisms involved. Our preliminary experiments showed that the BMSCs-derived exosomes up-regulated the expression of autophagy-related proteins in neurons of HIBD model. The exosomes contained substantial miR-125b-5p, and the latter specifically downregulated hypoxia-inducible factor 1-α inhibitor (HIF1AN). Bioinformatics analysis and literature research strongly suggest miR-125b-5p targeted the AMPK/Sirt1 signaling pathway, promote autophagy, reduce the apoptosis of neurons and play a protective effect in the HIBD model through regulating HIF1AN. Thus, in vitro and in vivo HIBD models will be established in this study to clarify the relationship among miR-125b-5p, HIF1AN, AMPK, Sirt1 as well as their regulation on autophagy, and evaluate the therapeutic effect of exosomes on HIBD, finally provide new ideas for the clinical treatment of HIE.

新生儿缺氧缺血性脑病（HIE）是新生儿期严重疾病，探索其修复机制至关重要。申请人以共同第一作者报道了骨髓间充质干细胞（BMSCs）在新生鼠缺氧缺血脑损伤（HIBD）中通过激活自噬发挥神经保护作用。本项目拟进一步深入探讨其中的分子机制。预实验发现BMSCs来源的外泌体使HIBD模型神经元自噬水平上调，该外泌体富含miR-125b-5p且可特异性下调低氧诱导因子1-α抑制因子（HIF1AN），生物信息学分析和文献调研强烈提示miR-125b-5p可能通过调控HIF1AN激活AMPK/Sirt1信号通路，促进自噬，减少神经元凋亡，在HIBD中发挥神经保护作用。因此，本课题将建立体内外HIBD模型，阐明外泌体富含的miR-125b-5p和HIF1AN、AMPK、Sirt1的关系及对自噬的调控作用，并对外泌体用于HIBD的治疗效果进行评价，为临床治疗HIE提供新思路。

新生儿缺氧缺血性脑病（hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE）是因围产期窒息所致的严重脑损伤。HIE是新生儿死亡和儿童致残的重大疾病，具有较高的发病率及病死率，存活者仍具有严重的神经后遗症如脑瘫、智力障碍等。本研究发现骨髓间充质干细胞（bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs）来源的外泌体对新生鼠缺氧缺血脑损伤模型中神经元具有保护作用，且使自噬标志蛋白Beclin1、LC3II及抗凋亡蛋白Bcl-2表达增加，而运用外泌体拮抗剂GW4869可以逆转上述现象。通过高通量测序及microRNA靶通路预测数据库推测，BMSCs来源的外泌体可能通过miR-125b-5p靶向调控HIF1AN，激活AMPK/Sirt1信号通路。本研究采用荧光素酶报告基因表达系统，进行miR-125b-5p对其靶基因调控的靶点验证，并采用qPCR、Western Blot检测神经元转染miR-125b-5p后，HIF1AN mRNA、HIF1AN蛋白的表达，确认HIF1AN为miR-125b-5p的直接靶点。本课题建立体内外HIBD模型，利用miR-125b-5p激动剂激活处理，神经元中miR-125b-5p、p-AMPK/AMPK、Sirt1、Beclin1、LC3II及Bcl-2表达增加。此外，水迷宫实验表明外泌体能改善新生鼠缺氧缺血性脑损伤。因此，在新生鼠缺氧缺血脑损伤中，外泌体通过miR-125b-5p靶向调控HIF1AN，激活AMPK/Sirt1信号通路，促进神经元自噬，减少神经元凋亡，从而促进神经元存活。本课题明确BMSCs来源的外泌体靶向调控自噬相关分子表达的microRNA及其信号通路，阐明外泌体miR-125b-5p介导的缺氧缺血神经元自噬调控机制，探索应用外泌体修复HIBD的可行性，为临床寻找治疗新生儿HIE的新措施提供科学参考。