前导肽促进链霉菌谷氨酰胺转胺酶折叠的研究

谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase，TGase)广泛应用于食品工业。链霉菌TGase以前体形式(Pro-TGase)合成，被切除N-端前导肽(pro-peptide)后转化成有活性的TGase。研究表明，TGase的前导肽对TGase的折叠有重要影响。本项目拟通过以下三个方面对前导肽促进TGase折叠进行系统研究：(1) 通过体外复性研究，捕获可能存在的TGase折叠中间体，确定前导肽促进TGase折叠的可能途径；(2) 通过对前导肽的突变，确定前导肽中影响TGase折叠的重要氨基酸，从分子水平上解析前导肽促进TGase折叠的机制；(3) 通过改造前导肽，得到具有高催化效率、pH稳定性、高热稳定及分泌表达性能的TGase，并由此得到前导肽序列与TGase酶学性质及分泌性能的对应关系。研究得到的相关结论将丰富以前体形合成的蛋白质的折叠机制，同时为酶分子改造提供新的范例和思路。

谷氨酰胺转胺酶(Transglutaminase，TGase)广泛应用于食品工业。链霉菌TGase以前体形式(Pro-TGase)合成，被切除N-端前导肽后转化成有活性的TGase。本项目以吸水链霉菌pro-TGase为研究对象，研究了前导肽对TGase在大肠杆菌中分泌表达及酶学性质的影响，并成功构建了pro-TGase食品级分泌表达系统。主要研究结果如下：(1) 前导肽对TGase分泌及酶学性质的影响 缺失loop43-53，pro-TGase突变体分泌量提高70%；缺失-螺旋37-42，对应的TGase比酶活提高12.3%。将-螺旋37-42分别替换成短肽AAA和GGG，对应TGase比酶活分别提高22.2%和24.8%，且前导肽的切割提高2倍；(2) 前导肽C端插入短肽提高TGase比酶活和热稳定性 将短肽GGGGS和PTPPTTPT插入前导肽C端的活化蛋白酶切割位点上游，使TGase比酶活分别提高28%和35%；将来源于TGase分子内部的短肽SPARPGESW 和 KTIWTHANH前导肽C端， TGase比酶活均提高40%，且后者使TGase热稳定性提高 90%；(3) pro-TGase在食品级系统中的表达 将pro-TGase经由高拷贝质粒pINA1297表达于解脂耶氏酵母，结合去糖基化及流加发酵策略，TGase胞外酶活达到35.00 U/mL，是目前报道的最高水产酶水平。上述研究结果初步揭示了前导肽调控TGase酶学性质及表达的作用功能基团，获得的食品级高效生产菌株将进一步促进TGase应用的推广。