NLRX1受体介导的信号通路对肠出血性大肠杆菌感染的免疫调控作用研究

Inflammation can be induced by bacteria to clear pathogens. However, excessive inflammation can also cause damage to the host. Our previous study showed that the expression of Nucleotide-binding domain and leucine-rich-repeat-containing family member X1 (NLRX1) was significantly up-regulated upon Enterohemorrhagic Escherichia coli (EHEC) infection in rabbits. Furthermore, we found that NLRX1 could inhibit the activation of NF-κB signaling pathway induced by EHEC. This implies that NLRX1 may play a negative feedback role in regulating inflammation during bacterial infection. In this project, the cellular localization and functional domain of NLRX1 will be determined by immunofluorescence and fluorescein reporter gene system after transfected with NLRX1 in rabbit kidney cells; Which TRAF protein interacts with NLRX1 to inhibit NF-κB signaling pathway will be determined by confocal laser scanning confocal microscopy and Co-Immunoprecipitation. The effects of downstream immune-related genes of NF-κB signaling pathway and EHEC proliferation will be studied by overexpression and interfering RNA technology. This study will further elucidate the mechanism of immune regulation induced by EHEC, and provide reliable ideas for the prevention and treatment of bacterial diseases.

细菌感染宿主后，诱导炎症反应，清除病原菌。但是过多的炎症反应也会对机体造成伤害。我们前期研究表明，肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）感染兔后，NOD样受体中的NLRX1显著上调。进一步研究发现，NLRX1能够抑制EHEC诱导的NF-κB通路的激活。这提示NLRX1在细菌感染过程中可能具有负反馈调节炎症反应的作用。本项目通过在兔肾细胞中过表达NLRX1，利用免疫荧光试验和萤火虫荧光素酶报告基因系统确定NLRX1的细胞定位和功能结构域；通过激光共聚焦和免疫共沉淀确定NLRX1与哪一TRAF蛋白相互作用抑制NF-κB信号通路；进一步通过过表达和siRNA技术探究NLRX1对NF-κB下游免疫相关基因以及EHEC增殖的影响。揭示EHEC感染后宿主的免疫调控机制，为细菌性疾病的防控和治疗提供可靠思路。

细菌感染宿主后，诱导炎症反应，以清除病原菌。但是过多的炎症反应也会对机体造成伤害。我们前期研究表明，肠出血性大肠杆菌（Enterohemorrhagic Escherichia coli, EHEC）感染兔后，NOD样受体中的NLRX1显著上调。进一步研究发现，NLRX1能够抑制EHEC诱导的NF-κB通路的激活。这提示NLRX1在细菌感染过程中可能具有负反馈调节炎症反应的作用。本项目通过在兔肾细胞中过表达NLRX1，利用免疫荧光试验确定NLRX1定位于线粒体。通过萤火虫荧光素酶报告基因系统证明NLRX1能够抑制NF-κB-luc活性。Western blot证明NLRX1能够减少IKK复合物和P65磷酸化，以及P65磷酸化入核，进而抑制下游炎性因子（IL1β、TNFα）和抗菌肽（α防御素NP5以及β防御素DEFB114、DEFB135）的表达。通过干扰RNA敲低NLRX1，表明敲低NLRX1能够促进NF-κB-luc活性，促进P65磷酸化入核，并促进炎性因子和抗菌肽的表达。反向证明NLRX1负反馈调控NF-κB通路。进一步通过过表达和敲低NLRX1证明NLRX1可以促进EHEC的增殖。并确定过表达NOD-LRR结构域能显著抑制NF-κB-luc的活性和P65磷酸化，表明NOD-LRR是其效应结构域。通过免疫共沉淀确定NLRX1在不刺激EHEC时与TRAF6存在相互作用，在EHEC刺激以后，NLRX1与TRAF6解离，并与TRAF4结合，发挥负反馈调节作用。.由于抗生素的限制使用，细菌性疾病在养殖业中的暴发呈上升态势，寻求抗生素替代品成为亟需解决的问题，越来越多的研究将先天性免疫系统中NLRs的配体、激动剂以及白介素等用于免疫调节剂或者疫苗佐剂，以期通过诱导机体的先天性免疫应答提高治疗或者免疫效果。本项目证明NLRX1能负反馈调控NF-κB通路，促进EHEC的增殖，敲低NLRX1后，EHEC增殖显著减少。对进一步研究其是否能够作为一种新型药物或作用靶点提供研究基础，为细菌病的治疗和防控提供新的思路和方法。