基于单细胞测序技术的人类口腔病原菌比较基因组学研究

Oral disease is one of the most prevalent diseases of human mankind, with periodontopathy marked as the world's third most violent illness by World Health Organization (WHO). As the most common chronic disorder of oral infectious disease, periodontitis also is the main reason for tooth loss of adult humans. Many literatures reported the community composition and function of human oral microorganisms, which demonstrated that periodontopathy is caused by changes of microbial community structure, and some pathogens are the key factor for periodontitis. Recent achievements of cell heterogeneity showed that different strains of the same pathogenic species may have distinct pathogenicities. In this study, we will explore the strain level of genetic diversity and their pathogenic potentials in oral pathogens. Single cells will be labeled by specific fluorescent probes at the species level and then will be sorted by flow cytometry. We will apply Multiple Displacement Amplification (MDA) and high throughput sequencing approaches to obtain their genomic sequences. Strain-level genetic variation, toxin genes and metabolic pathway of certain pathogens will be analyzed based on comparative genomics approaches, to illustrate the mechanism of periodontitis caused by specific strain of pathogenic microorganisms, and to look for more efficient molecular markers for diagnosis. This study will enrich our understanding of the genetic diversity and pathogencity of human oral pathogens, and will also shed light on clinical diagnosis, treatment and prevention of periodontitis.

人类口腔疾病是最常见的多发性疾病，其中牙周病已被世界卫生组织列为世界第三大疾病。牙周炎是最常见的慢性牙周疾病，也是成年人牙齿缺失的最主要原因。大量研究报道揭示了人类口腔中微生物的群落组成及其功能，发现微生物群落变化导致牙周疾病的发生，部分致病菌是牙周炎形成的关键因素。细胞异质性研究表明同种细菌的不同菌株致病性存在明显差异，为进一步揭示口腔致病菌的菌株遗传多样性及致病机理，本研究拟采用种水平特异性荧光探针标记方法分选牙周炎重要致病细菌的单细胞集合，结合全基因组扩增和高通量测序技术，通过比较基因组学方法从单细胞尺度研究病原菌的遗传变异、毒力因子及相关代谢途径等内容，阐明病原微生物特定菌株在牙周疾病形成过程中的作用，同时寻找鉴定高致病性菌株的分子标记。此项研究不但可以丰富病原菌的基因组资源，还可以为牙周炎疾病的临床快速诊断、特效治疗以及预防提供重要理论依据。

人类口腔疾病是最常见的多发性疾病，其中牙周炎是最常见的慢性牙周疾病，也是成年人牙齿缺失的最主要原因。大量研究报道揭示了口腔微生物群落变化导致牙周疾病的发生，部分致病菌是牙周炎形成的关键因素。本研究通过建立新的宏基因组学实验策略和分析算法，重点解析菌株基因组的拼接完整性及准确性，分析病原微生物的遗传变异与种下多态性，构建16S物种谱数据与宏基因组拼接序列物理关联，校正或补充彼此注释的结果，实现准确无偏的宏基因组数据解析，进而快速、准确和全面地解析口腔样品中微生物的组成和功能。利用流式细胞术对人体口腔宏基因组样品中的细菌进行排序，然后分选出指定区间内的细菌子集。随后，利用单细胞技术对每个细菌子集进行全基因组扩增和高通量测序，采用新研发的算法模型：BAF和MGA对结果进行解析，能够检测到Enterobacter cloacae和Enterobacter hormaechei等低丰度物种，可以特异性组装和拼接菌株基因组序列（例如：Prevotella属），同时发现Streptococcus parasanguinis和Veillonella sp. 菌株具有不同丰度的种下多态性。通过核糖体侧翼序列环化测序及计算技术，同时获得16S rRNA V4/6高变区及16S rRNA上游的蛋白编码基因序列，建立16S rRNA与宏基因组拼接序列的物理关联，对样品中的物种进行重新分类注释，准确定位多拷贝16S rRNA基因的位置信息，辅助细菌基因组的拼接。来源于Oral-A样品的506条未注释片段，Oral-E1样品的338和Oral-E2样品的352条未识别片段能够被核糖体侧翼序列高通量测序法注释。本项目通过建立全新的宏基因组学研究方法解析人体口腔微生物的群落结构与功能，并从菌株基因组水平探讨口腔疾病的形成机制，结果为相关疾病的预防和诊治提供重要理论依据，也为其他环境的宏基因组学研究提供全新的思路和方法。