新型脯氨酰顺反异构酶Pin1抑制剂的发现及其抗肝癌活性研究

Peptidyl-prolyl cis/trans isomerase Pin1, binding to the phosphorylated Ser/Thr-Pro motif and catalyzing configurational change in a subset of proteins, is a key regulator in physiological processes including cell cycle progression, RNA processing and cell proliferation. Aberrant biogenesis of Pin1 protein and global microRNAs (miRNA) are closely related to hepatocellular carcinoma (HCC) development. Our previous studies demonstrated that Pin1 reduced the biogenesis of mature miRNA and promoted tumor cell proliferation via altering exportin-5 configuration and blocking nucleus-cytoplasm transportation of pre-miRNA, indicating the therapeutic potential of Pin1 in HCC. Thus, this project will screen novel specific Pin1 inhibitors through PPIase activity assay, cell proliferation assay, mouse model of HCC combined with computer-assisted virtual screening. Subsequently, the following techniques will be employed to investigate how Pin1 inhibitor impacts on mature miRNA biogenesis and biological function of HCC cells, including structural analysis of co-crystals, co-immunoprepicipation, confocal microscopy and RNA-binding protein immunoprecipitation assay. Our research will provide experimental and theoretical basis for the treatment of liver cancer using Pin1 as a novel target.

脯氨酰顺反异构酶Pin1催化磷酸化丝氨酸/苏氨酸-脯氨酰基序发生顺反异构，调节靶蛋白构型，参与细胞的各种生理过程。Pin1及microRNA（miRNA）的异常生物合成，与肝癌的发生发展密切相关。我们前期研究发现Pin1通过调控磷酸化XPO5构型，阻碍XPO5与pre-miRNA的结合及其对pre-miRNA的核质转运，降低成熟miRNA生物合成，促进肝癌增殖。因此，Pin1可作为肝癌治疗的新靶点。本项目将在前期研究基础上，采用计算机辅助药物筛选、PPIase活性抑制实验、肝癌细胞增殖实验和肝癌动物模型实验，发现新型抗肿瘤Pin1靶向抑制剂。同时，利用蛋白-小分子共结晶、共聚焦显微镜、免疫共沉淀、RNA结合蛋白免疫共沉淀等分子、细胞生物学实验，阐明Pin1抑制剂调控成熟miRNA生物合成、影响肝癌细胞生物学特性的分子机制，为肝癌治疗提供理论依据。

在世界范围内，肝癌是导致癌症死亡的主要原因，但目前有效的治疗方法还十分缺乏。异常的microRNA（miRNA）生物合成与肝癌的发生发展密切相关。我们之前的研究表明，脯氨酸顺反异构酶Pin1参与miRNA的生物合成，是一个潜在的肝癌治疗靶点。但目前尚不清楚Pin1调节miRNA生物合成、影响肝癌发生发展的分子机制。本研究中，我们通过对临床样本的分析，证实Pin1过表达在肝癌的发展过程中扮演重要角色。通过计算机辅助药物虚拟筛选，我们发现了新型Pin1抑制剂API-1、API-17、AF-29及TAB29。Pin1抑制剂可以通过K63和R69等关键氨基酸残基，特异性地结合到Pin1的PPIase结构域，抑制Pin1的顺反异构化活性。Pin1抑制剂对其它脯氨酰顺反异构酶（如Pin4、FKBP12和Cyclophilin A）抑制作用很弱，表现出很好的靶标特异性。另外，Pin1抑制剂可有效抑制肝癌细胞增殖和迁移，但其抗癌作用对Pin1低表达和/或低XPO5磷酸化水平的肝癌细胞并不敏感。以Pin1抑制剂作为分子工具，我们研究了Pin1调控miRNA生物合成的机制：Pin1特异性地识别和催化XPO5的磷酸化丝氨酸/脯氨酸基序发生顺反异构，改变XPO5构象，钝化XPO5功能；而Pin1抑制剂对Pin1的抑制作用能够保持XPO5的活性构象，恢复XPO5对pre-miRNA核质转运，激活抗肿瘤miRNA的生物合成，从而在体外和体内水平上抑制肝癌发生发展。整体上，我们发现的新型Pin1抑制可通过保持XPO5活性构象的方式上调miRNA的生物合成，抑制肝癌的发展，揭示了Pin1介导miRNA的生物合成的分子机制。同时，Pin1抑制剂可作为一种新型的肝癌治疗的候选药物，特别对ERK激活/Pin1过表达型肝癌效果显著。本研究成果在Hepatology、Chemistry - An Asian Journal和Bioorganic & Medicinal Chemistry发表SCI研究论文3篇；受邀在Frontiers in Cell and Developmental Biology发表前沿综述；发表于Hepatology的文章入选ESI高被引论文，荣获四川省医学会2019年度优秀论文奖；获得一项国家发明专利授权；培养1名博士研究生和2名硕士研究生，并获得学位。