全外显子组测序法鉴定两个近亲婚配的低血磷性骨软化家系致病基因突变及功能研究

Hypophosphatemic rickets/osteomalacia is characterized by bone pain, mucle weakness, and serious patients may suffer from pseudo fractures, fractures and bone deformities. Blood tests show low serum phosphorus and high serum alkaline phosphatase. Recently, significant progress has been made in virulence gene research of this disease. The gene responsible for XLH was identified as PHEX in 1995. After that, The genes mutated in ADHR、HHRH、ARHR1 and ARHR2 have been identi?ed as FGF23, SLC34A3, DMP1 and ENPP1. However, the virulence gene of many sporadic cases have not been found. We make clinical diagnosis of two probands of hypophosphatemic osteomalacia who had family histories of consanguineous marriage. And we failed to find mutations of the genes above in the gene screening. To this end, the project intends to use the whole-exome sequencing method to detect the two probands and their parents to identify the virulence gene mutations. And we will do functional studies after that. The gene mutant will be transferred to the cultured C3H10T1/2 cells. Then we will study the gene expression in transfected cells, and analyze the impact of the gene transfection on the biological behavior of the cells. Finally, we will do direct sequencing to check the identified mutations among 42 sporadic patients.The project is expected to identify new virulence gene of hypophosphatemic rickets/osteomalacia, and of great significance to deepen the molecular mechanism of the disease.

低血磷性佝偻病/骨软化是以骨痛、肌无力为特征，严重者出现假骨折、骨折甚至骨骼畸形。生化特点为血磷降低，碱性磷酸酶显著升高等。近几年对遗传性低磷性佝偻病/骨软化致病基因研究获得重大进展，相继鉴定了XLH，FGF23，SLC34A3，DMP1和ENPP1等致病基因。但仍有很多遗传性及散发病例的致病基因仍未探明。我们临床诊断了两个近亲婚配低磷骨软化家系，基因筛查中并未发现上述致病基因突变。为此，本项目拟使用全外显子组测序法对2个先证者及其父母进行检测以鉴定致病基因突变；其次开展功能研究，证实其发病机制，将突变体转入体外培养的C3H10T1/2细胞，研究该基因在转染细胞中的表达，并分析该基因转染对细胞生物学行为的影响；最后对42例散发性低磷性佝偻病/骨软化患者检测本研究中找到的突变基因。本项目有望鉴定到导致低磷佝偻病/骨软化的新致病基因，对深化该疾病的分子机制具有重要意义。

低血磷性佝偻病/骨软化是以骨痛、肌无力为特征，严重者出现假骨折、骨折甚至骨骼畸形。生化特点为血磷降低，碱性磷酸酶显著升高等。近几年对遗传性低磷性佝偻病/骨软化致病基因研究获得重大进展，相继鉴定了PHEX，FGF23，SLC34A3，DMP1和ENPP1等致病基因。但仍有很多遗传性及散发病例的致病基因仍未探明。我们临床诊断了两个近亲婚配低磷骨软化家系，基因筛查中并未发现上述致病基因突变。为此，本项目使用全外显子组测序法对2个先证者进行检测以鉴定致病基因突变。分别找到可能致病的45个和84个纯合突变位点，目前尚不能确定致病突变。在发病例数较少的近亲婚配家系中，运用二代测序法，虽然能够获得海量数据，但分析总结突变位点仍旧很困难。后期可能需要更先进的统计分析方法，并进一步扩大样本量来寻找突变位点。.为了明确散发性低血磷性佝偻病/骨软化的致病突变，我们挑选了与磷代谢有关的基因，定制Agilent富集芯片。用二代测序法检测了186例病例的制定目标区域，196个基因的coding区域以及UTR区域和启动子2k区域和剪切位点25bp设计了探针，探针总长度为1M，数量为15099条。覆盖了上述给定区域的95.8%。病例来自于我们近10年来收集到的散发性低血磷性佝偻病/骨软化患者，86例；以及本科室的DNA库中随机抽取100例健康人的标本。我们在7个不同的病人身上检测到7个不同的PHEX突变位点，其中6个是新发现突变，1个是已知位点突变。我们还检测到1个病人携带一个新的DMP1突变位点。另外通过数据分析，我们找到14个新的杂合突变位点，是可能的致病突变。目标区域测序该方法能够获得指定目标区域的遗传信息，极大地提高了基因组中特定目标区域的研究效率，显著降低了研究成本。我们将此方法应用于低磷骨软化患者，在国内尚属首次。通过此次研究，筛选到了多个基因突变位点，并通过Sanger直接测序法验证证实。通过目标区域测序，可以对候选位点或候选基因进行验证，也可以进一步找到候选区域或候选基因内的易感位点。今后，随着我们的样本量的扩大，此方法的优势将更加凸显。