内质网应激在腺苷诱导HepG2细胞凋亡中的作用及机制

在前期工作中，我们证实腺苷（Ado）对HepG2的细胞毒作用与通常的死亡受体及线粒体通路无关，但伴有caspase-3、-4等蛋白表达的变化，推测其毒性是通过内质网途径起作用。内质网应激早期通过未折叠蛋白反应如增加分子伴侣GRP78表达保护细胞生存，晚期才启动凋亡，而凋亡有多条途径。本项目在前期工作基础上，采用定量PCR、免疫印迹、激光共聚焦显微镜等方法，观察Ado作用后Ca2+浓度、分子伴侣GRP78、跨膜蛋白及内质网凋亡通路相关蛋白caspase-4、CHOP、Cyclin D等的变化；使用RNAi技术沉默GRP78基因并观察细胞凋亡率的变化及对其它基因表达的影响，从时间动力学角度研究凋亡相关基因表达产物的峰值及"内质网应激时限"，比较单用Ado及Ado联合基因治疗的抗癌效果，对于揭示Ado毒理学作用机制，阐明内质网凋亡通路信号传导的生化基础，为开发腺苷类药物及肿瘤化疗增效剂打下基础。

在此项研究中，我们1）首先研究了NF-κB和caspase-3在腺苷介导的细胞凋亡中的作用。2）明确ADO 诱导肿瘤细胞（HepG2， EC109）凋亡时与内质网应激有关及其机制；3）使用RNA干扰（RNAi）技术，观察GRP78在肿瘤耐药中的作用。. 1. 将不同浓度的ADO作用于HepG2细胞，结果导致细胞周期G0/G1阻滞，上调了caspase-3、p53及NF-κB p65蛋白表达。 使用NF-κB抑制剂（PDTC）则降低了caspase-3 活性及细胞凋亡，表明ADO具有明显抗癌作用，在此过程中NF-κB活化起保护癌细胞作用。抑制NF-κB活性可增强ADO的抗癌效果。. 2. MTT法证实ADO对HepG2细胞产生剂量依赖性的毒性作用，DAPI染色及细胞周期检测证实细胞出现了凋亡。 免疫荧光分析表明ADO处理后Caspase-3和CHOP从胞质易位进入胞核，Western blot分析显示Caspase -4、Caspase -3、CHOP表达上调，但JNK的表达没有变化。ADO还可显著增加细胞内游离钙浓度，同时伴有m-calpain、Caspase-4、Caspase -3表达水平明显增高，表明钙稳态失调导致的Caspase-4通路活化是内质网应激的重要机制。内质网应激在ADO诱导的肿瘤细胞凋亡中发挥了重要作用。我们也证实ADO内质网应激参与了ADO诱导的食管癌EC109细胞凋亡。. 3．采用RNA干扰技术构建含干扰GRP78基因的腺病毒载体，结果表明单纯抑制GRP78并不产生细胞毒作用。但敲除GRP78后可增强ADO细胞毒效果，使细胞周期阻滞在G0/G1期，增加了Bax，BAK，m-calpin，Caspase-4 和CHOP蛋白的水平；敲除GRP78还加重了钙超载及线粒体膜电位改变。敲除Caspase-4减少了caspase-3的表达和细胞凋亡。明确了内质网应激通路在ADO细胞毒作用中的调节机制。. 本项目按计划顺利完成。通过系统研究，证实腺苷对肝癌及食管癌细胞均有毒性作用，是有前景的抗癌药物。采用“基因打靶”技术剔除耐药基因可增加腺苷毒性效果，开辟了临床治疗肿瘤新途径。本项目完成共发表论文6篇，其中SCI论文4篇，中文核心期刊2篇，参加国际会议学术交流2次。培养了5名研究生，均以优异成绩毕业。