骨髓微环境调控骨髓瘤细胞RANKL表达的作用机制研究

RANKL play a pivotal role in the development of osteolytic bone lesions in multiple myeloma. On the other hand recent data shows that RANKL expression is regulated by promoter methylation. We aimed to study the regulation of RANKL expression in myeloma cells by promoter methylation. We first determined the methylation status of RANKL promoter in 10 human myeloma cell lines using methylation-specific polymerase chain reaction (MSP). We found that RANKL promoter was completely methylated in WL-2 and LP-1. Hypomethylation treatment (5-AzadC) of WL-2 and LP-1 myeloma cells led to demethylation of RANKL promoter and upregulation of RANKL expression. Furthermore, co-culture of the normal bone marrow-derived mesenchymal stromal cells (MSC) with WL-2 or LP-1 myeloma cells in a transwell system for 6 days resulted in repression of DNA methyltransferase-1 (DNMT-1), demethylation of RANKL and upregulation of RANKL expression in WL-2 or LP-1 myeloma cells. To clarify the mechanism involved in the demethylation of myeloma cells, demethyaltion related protein expression in myeloma cells will be determined after transwell coculture of MSC and WL-2 or LP-1. The cytokines secreted by MSC will be used to treat myeloma cells directly to explore which cytokines is involved the demethylation mechanism. Meanwhile, to discover the bone marrow microinviroment effect on myeloma cells RANKL myethyaltion and expression, the subcutaeous transplantated fetal bone will be injected with WL-2 or LP-1 cells in the SCID/Hu mouse myeloma modle, and the CD138+ myeloma cell will be separated through microbead method and the RANKL methyaltion and expression will be determind. The project devotes to reveal the new mechanism of myeloma bone lesion and find the new target for treatment of myeloma bone lesion.

RANKL是导致骨髓瘤骨病发生的重要因子,研究显示其表达受启动子区甲基化的调控。我们前期研发现骨髓瘤细胞WL-2和LP-1的RANKL启动子呈完全甲基化，5-AzadC可导致它们发生去甲基化和RANKL表达上调，MSC与骨髓瘤细胞株transwell共培养可使细胞RANKL发生去甲基化并上调RANKL表达。本项目拟在前期研究的基础上，采用MSC与WL-2或LP-1共培养，检测多种去甲基化蛋白的变化，并采用多种MSC分泌的细胞因子干预两种骨髓瘤细胞，探讨何种细胞因子导致骨髓瘤细胞RANKL发生去甲基化。同时采用骨髓瘤SCID/Hu小鼠模型，观察体内微环境对骨髓瘤细胞RANKL甲基化和表达的影响，确证微环境通过去甲基化机制调控骨髓瘤细胞RANKL表达。本项目分别通过体外和体内模型，探讨骨髓微环境调控骨髓瘤细胞RANKL表达的分子机制，为探索骨髓瘤骨病的发生开辟新思路和新途径。

多发性骨髓瘤是一种血液肿瘤，其特征在于骨髓中恶性浆细胞的克隆扩增，同时伴随成骨细胞减少，骨髓间充质基质细胞的破骨细胞分化增强，并因此导致溶解性骨病变。因此，我们研究了骨髓瘤骨病和骨髓瘤浆细胞的生物学变化。..首先，RANKL基因是破骨细胞分化和活化的关键促成因子，我们证明了RANKL受到骨髓瘤细胞中启动子DNA甲基化的调控。甲基化介导骨髓瘤细胞中RANKL基因的沉默，被证实受骨髓微环境中TNFα的调节，通过DNMT1的下调和靶向DNMT1的miRNAs，miR-126-3p和miR-140的上调。因此，虽然已知RANKL由骨髓间充质基质细胞 （BMSC）分泌，但我们的数据显示RANKL也由骨髓瘤浆细胞（MMPC）分泌，通过在骨髓微环境TNFα影响下，DNMT1下调引起RANKL启动子低甲基化。..其次， miR-34c 在骨髓瘤样本的BMSC中表达显著高于正常的对照组，并且与其直接靶基因RUNX2呈负相关，因此降低了骨髓瘤患者中BMSC的成骨细胞分化。此外，正常BMSC中miR-34c的表达， 在BMSC与MMPC结合后表达增强。因此，我们的数据表明，除了MMPC分泌RANKL促进破骨细胞活化之外，MMPC结合BMSC也可以通过miR-34c上调和RNUX2的下调，来抑制成骨细胞分化。..同时，我们也证实骨髓瘤细胞中，抑癌内含子miRNA，miR-28-5p和miR-342-3p，分别受其相应宿主基因LPP和EVL的启动子DNA甲基化的调节，具有肿瘤特异性和可逆沉默的特点。在骨髓瘤细胞系中，miR-28-5p表达与其致癌靶基因CCND1的表达负相关，表明miR-28-5p可能是肿瘤抑制性miRNA。此外，EVL/miR-342甲基化可以在症状性骨髓瘤出现之前的良性病症，单克隆丙种球蛋白病 （MGUS）中检测到，表明甲基化参与骨髓瘤形成的早期发生。..另一方面，甲基化介导的抑癌长链非编码RNA （lncRNA）BM742401, 对总体存活率呈负相关。同时，通过蛋白质印迹，我们证实了无论是否存在RAS/RAF突变，在大多数复发难治型骨髓瘤（RRMM）中都可以检测到RAS信号通路的功能性激活，因此RAS信号通路是RRMM中药物靶向的重要途径。..最后，在骨髓瘤中，多部位骨髓瘤浆细胞除了具有空间基因遗传异质性之外，我们也首次证明了空间表观遗传异质性。