mRNA的m6A甲基化修饰对精原干细胞增殖与分化的调控作用与机制研究

Spermatogonial stem cells (SSCs) are the adult stem cells in male testis tissue. SSCs are capable of differentiation to generation of spermatozoa, and also transformation to pluripotent stem cells. Methylation on mRNA at N6-adenosine (N6-methyladenosine, m6A) could affect the stemness of embryonic stem cells. However, the regulation of m6A methylation on SSC proliferation and differentiation remains unknown. In this proposal, m6A methylation profile of SSC mRNA in pigs and mice will be revealed by MeRIP-seq and bioinformatic analysis. The regulatory roles of candidate proteins of m6A methylation on SSC proliferation and differentiation will be analyzed via lentivirus-mediated shRNA, CRISPR/Cas9 and SSC transplantation. Using RNA-affinity pull down, CoIP and LC-MS/MS, the mechanisms how m6A methylation modulates the SSC proliferation and differentiation will be elucidated. The findings of this proposal will be helpful for further study of SSC biology, and will provide information for the study of the other adult stem cells as well.

精原干细胞是位于睾丸组织中的成体干细胞，既能分化产生精子，又能转化为多潜能性干细胞。mRNA的甲基化修饰（m6A）对胚胎干细胞的干性维持具有重要作用，但对成体干细胞的调控作用尚不清楚。本项目拟以猪和小鼠精原干细胞为材料，利用MeRIP-seq结合生物信息学分析，建立精原干细胞mRNA 的m6A修饰图谱，比较在进化上精原干细胞m6A甲基化修饰的保守性；利用慢病毒介导shRNA、CRISPR/Cas9基因编辑和精原干细胞移植等技术探究METTL3等候选m6A修饰蛋白对精原干细胞增殖与分化的调控作用；利用RNA-affinity pull down、免疫共沉淀、LC-MS/MS等方法研究候选m6A修饰蛋白对精原干细胞增殖与分化的调控机制。本研究结果将为深入研究猪和小鼠精原干细胞的生物学特性提供理论依据，也将为其他家畜精原干细胞和成体干细胞的研究提供理论参考。

N6-腺苷甲基化（m6A）是真核生物mRNA中丰度最高，分布最广的一种RNA修饰。m6A参与调控多种生物过程，但是m6A修饰在精原干细胞增殖分化和精子发生中的功能和作用机制尚不清楚。.项目组圆满完成了项目预期目标，并取得了如下研究成果：.(1) 使用m6A去甲基化酶FTO的抑制剂乙酯形式的甲氯芬那酸（MA2）对精原细胞处理，以抑制FTO去甲基化酶的活性。结果表明MA2可抑制FTO去甲基化酶的活性，引起精原细胞mRNA的m6A修饰丰度增加，细胞周期调节蛋白CDKs基因的表达下调，从而诱导了细胞周期G1/S阻滞，抑制精原细胞增殖。.(2) 利用CRISPR/Cas9技术构建了Fto基因敲除的精原细胞细胞株，并完成表型检测和机制探究。结果表明FTO通过调控SAC和CDK1/CCNB2的表达，影响染色体分离和细胞周期进程；FTO通过m6A/mRNA降解途径调控靶基因的表达，进而调控精原细胞染色体稳定性和细胞周期进程。.(3) 利用CRISPR/Cas9技术构建了m6A识别蛋白基因Ythdf2敲除的精原细胞细胞株；利用RNA-seq完成了Fto及Ythdf2敲除的精原细胞细胞株的转录组测序，探究其调控机制。结果表明YTHDF2通过m6A/mRNA降解途径调控关键基质金属解离酶MMP基因的表达，进而影响精原细胞的黏附。.(4) 收集猪不同阶段生殖细胞并进行m6A测序，建立了猪不同阶段生殖细胞的m6A修饰图谱；生物信息学方法分析表明m6A修饰可通过调控精子发生相关基因的表达，从而调控精子发生过程。此外，通过分析及试验证明m6A可调控组蛋白修饰基因SETDB1的表达，从而调控精原细胞的功能。.(5) 鉴于慢病毒、脂质体或电转等方法转染精原干细胞效率均低，为了研究精原干细胞增殖分化的调节机理，建立了基于纳米材料G5-cRGD高效转染原代精原干细胞的技术体系。.本项目研究结果对于揭示 SSCs 增殖与分化的分子机理具有重要意义，也将为其他家畜 SSCs 和其他成体干 细胞的相关研究提供理论参考。