EGR1调控TWIST1-Sox9负反馈回路促进VICs向CBs转分化致瓣膜粘液变性的研究

Aortic valve calcification (AVC) and myxomatous mitral valve (MVC) are the main clinical types of degenerative heart valve disease. Compared with the huge progress made in AVC, there are few studies on MMV. Although it has been clarified that the transdifferentiation of valve interstitial cells (VICs) into chondrocytes (CBs) is the main cause of MMV, the mechanism is unclear. Recently, during exploring the mechanism of transdiffereation from VICs into osteoblasts, we found that EGR1 gene could promote the expression of Sox9, a core transcription factor of CBs, by inhibiting TWIST1. Furthermore, Sox9 and TWIST1 mutually inhibited each other. Accordingly, we propose the hypothesis that "EGR1 regulates TWIST1-Sox9 negative feedback loop to promote VICs transdifferentiated into CBs." To test this hypothesis, we will examine the role of EGR1 in the transdifferentiation of CBs. Functional assays such as ChIP will be used to analyze the regulation of EGR1 on TWIST1 and the mutual regulation of TWIST1 and Sox9. Finally, we will examine whether this pathway play an important role in MMV by using clinical tissue specimens and animal models. Through this study, we will try to clarify the mechanism of transdifferentiation from VICs to CBs, and provide a target for the prevention and treatment of MMV.

主动脉瓣钙化(AVC)和二尖瓣粘液样变性(MMV)是退行性心脏瓣膜病的主要临床类型。与AVC方面所取得的巨大进展相比,MMV相关研究较少。虽已明确瓣膜间质细胞(VICs)向软骨母细胞(CBs)转分化是导致MMV的主要原因,但机制不清。新近,我们在研究VICs向骨母细胞转化致瓣膜钙化时发现,早期生长反应1(EGR1)基因通过抑制TWIST1能促进CBs核心转录因子Sox9的表达,而Sox9与TWIST1又相互抑制。据此,我们提出” EGR1调控TWIST1-Sox9负反馈回路促VICs向CBs转分化”的假说。为验证该假说,我们先后检测EGR1在CBs转分化中的作用,借助ChIP等功能实验逐级分析EGR1对TWIST1的调控、TWIST1、Sox9之间的调控，并在临床组织标本和动物模型中明确该通路在瓣膜粘液变性中的作用。通过此研究，力图阐明VICs向CBs转分化的机制，为MMV的防治提供靶点。

本项研究分五部分内容，探索退行性瓣膜病的主要临床类型二尖瓣粘液变性的发病机制。研究内容一，通过病理学分析确定瓣膜海绵层内粘液样物质堆积是二尖瓣粘液变性瓣膜的病理学特征，并检测到瓣膜间质细胞（VICs）呈激活状态。为分析VICs激活的机制，我们建立VICs激活模型，通过细胞功能实验证实透明质酸参与VICs激活，即TGF-β1触发Smad3/HAS2/CD44信号轴促进VICs激活。另外，我们通过二尖瓣粘液变性瓣膜的表达谱数据GSE109744，筛选到ACTC1、ITG1、APCA1等hub基因；通过GO富集和KEGG信号通路分析发现上调表达的差异基因主要富集在细胞迁移、伤口愈合的通路，下调表达的差异基因主要富集在细胞骨架重组、收缩等信号通路。研究内容二，探索EGR1-Twist1-SOX9信号轴在二尖瓣粘液变性瓣膜中的表达和调控机制。以正常二尖瓣为对照，证实二尖瓣粘液变性瓣膜中EGR1 mRNA表达降低，Twist1和SOX9 mRNA表达升高。联合采用荧光素酶报告基因检测证实，EGR1在转录水平负性调控Twist1的表达，Twist1在转录水平负性调控SOX9的表达；随后，进一步采用GESA分析EGR1、Twist1、SOX9的功能。研究内容三，探索SOX5-Twist1/Runx2信号轴在二尖瓣粘液变性瓣膜中的表达和调控机制。以正常二尖瓣为对照，证实二尖瓣粘液变性瓣膜中SOX5 mRNA表达降低、Runx2 mRNA表达升高。联合采用荧光素酶报告基因检测证实，SOX5在转录水平正性调控Twist1的表达，并在转录水平负性调控Runx2的表达。研究内容四，对比分析二尖瓣VICs（mVICs）和主动脉瓣VICs（aVICs）之间生物学特征的差异。结果显示aVICs在细胞周期S期的细胞占比显著高于mVICs，并更容易发生钙化。建立氧化应激模型，通过流式细胞分析，确定相同氧化应激条件下，aVICs总凋亡率与mVICs相比均无明显差异。在研究内容五，探索内皮间质转化在二尖瓣粘液变性中的作用，以脐静脉内皮细胞、肺动脉内皮细胞的内皮间质转化模型为对照，共筛选到134个内皮间质转化相关基因在二尖瓣粘液变性瓣膜中表达。GO富集分析和KEGG通路分析表明，这些基因与免疫、炎症反应、细胞外基质合成，以及蛋白结合相关。在项目执行期间，共发表标注基金的SCI论文3篇，中文论文1篇。