珍稀濒危药用植物台湾金线莲菌根差异表达的转录组研究

兰科菌根属于一种典型的共生体系，对兰科植物的生长繁育和系统进化是必须的。兰科菌根共生分子机制目前仍不清楚，制约了兰科植物资源的合理开发、利用与保护。课题组前期围绕珍稀濒危兰科药用植物台湾金线莲（Anoectochilus formosanus）与瘤菌根菌属真菌AR-18形成的菌根共生体，从细胞学、组织学、生长代谢及生理生化等方面开展了大量研究工作。在此基础上，本项目拟以该菌根共生体为材料，通过数字表达谱分析，以454 GS FLX测序获得的未接种根全转录组数据为参比，明确菌根共生差异基因表达特征和网络；采用定量PCR和RNA原位杂交分析目标基因在菌根形成过程中的时空表达特征和作用位点，为揭示兰科菌根共生分子机制奠定基础，进而为兰科药用植物资源可持续发展提供理论指导。

按照原项目计划基本完成主体内容，取得以下研究结果：.① 利用盆栽实验，发现接种真菌MF23能显著促进金线莲株高、干重和活性成分，Kinsenoside和黄酮在接种根中的含量为对照的1.86倍和2.961倍。② 光学显微镜技术研究发现，共培养60 d二者初步互作，皮层细胞中散生零星菌丝，120 d形成较典型的菌丝节结构。③ 双向电泳结合MALDI-TOF/TOF质谱法的金线莲菌根蛋白质组学研究发现，22个差异蛋白功能涉及信号转导、代谢调节以及能量等相关途径，说明真菌通过影响基础代谢促进金线莲的生长发育。④ 采用RT-PCR克隆9个金线莲内参基因片段；结合qPCR和geNorm分析，筛选8个内参基因并明确其扩增效率、表达丰度、表达稳定性以及最适数目；表达稳定性依次为ACT-2/EF-1β﹥18S rRNA﹥UBQ﹥EF-1α﹥ACT-1﹥26S rRNA﹥GAPDH，经鲨烯合酶基因SS表达模式验证明确ACT-2/EF-1β为理想的内参。⑤ 以接种真菌120 d时的菌根共生体为材料，接种和对照设两个重复，采用Illumina HiSeq2000进行转录组RNA-seq分析。4个样本产生高质量Clean reads数目为37373232/Af-t1、35068852/Af-t2、28003742/Af-c1和30582362/Af-c2；Trinity拼接获得152969条unigenes，40.88%在7大数据库（Nr，Nt，Pfam，KOG，Swiss-prot，KEGG和GO）中得到注释，Nr库注释率最高为35.48%；KOG注释到26个蛋白直系同源簇，general function prediction only基因数目最多（22.45%）；KO注释到32个KEGG代谢通路，carbohydrate metabolism类基因数目最多。⑥ 差异基因表达分析表明，感兴趣的192个基因受真菌侵染上调，17个下调，功能涉及细胞信号转导、蛋白质代谢、物质转运和能量代谢等途径，说明菌根共生主要是宿主植物一系列复杂的生理生化反应的结果。对参与共生体维系的蛋白激酶、转录因子、蛋白代谢等重要基因的分子作用模式尚需深入研究。.受本项目资助，部分研究结果发表学术论文3篇，其中SCI论文2篇，培养研究生3名。