家蚕“薄茧”突变体形成的分子机理研究

The silkworm genome provides important resources for molecular breeding of silkworm. However, it is very hard to identify genes responsible for silk synthesis from the silkworm genome. PiggyBac-based random insertional mutagenesis has been successfully used in model species including Drosophila. In our previous study, a piggyBac-based random insertional mutagenesis library was constructed in Bombyx mori, one mutant with “thin cocoon” was screened, and four insertion sites were identified. However, the functions of these mutant genes have not yet been studied. In this project, researches will be carried out from the following 3 aspects: 1) Phenotype analysis of the “thin cocoon” mutant; 2) Exploring the function of those mutant genes by RNAi and Crispr/Cas9 techniques; 3) Constructing transgenic silkworm to increase silk synthesis. This project will elucidate the molecular mechanisms of “thin cocoon” mutant and identify genes responsible for silk synthesis. It may not only help to understand the mechanism of silk synthesis, but also provide some useful genes for transgenic breeding of silkworm in the future.

家蚕基因组为开展家蚕分子育种提供了宝贵的基因资源。然而，如何从上万个候选基因中鉴定出与丝蛋白产量相关的基因却异常困难。基于piggyBac转座子的随机突变体库在果蝇等模式物种基因筛选中得到了成功的应用。在前期研究中，我们应用piggyBac转座子构建了家蚕随机插入突变体库，并从中筛选出了一个“薄茧”突变体。初步鉴定出了4个转座子插入位点，但这些突变基因的功能并没有得到揭示。为此，本课题将继续研究：1）"薄茧“突变体表型性状分析；2）基因组文库Southern杂交，全面鉴定所有转座子插入位点；2）应用RNAi和Crispr/Cas9技术分析突变基因在蚕丝产量形成方面的功能；3）构建转基因家蚕，以提高蚕丝产量。该研究将揭示家蚕“薄茧”突变体形成的分子机制，鉴定出与蚕丝产量相关的功能基因。这不仅有利于解析家蚕蚕丝产量形成的分子机制，还有可能为家蚕育种提供新的靶基因，培育更加高产的家蚕新品种。

家蚕基因组测序的完成，为家蚕分子育种提供了宝贵的基因资源。然而，如何从家蚕基因组中鉴定出与蚕丝产量相关的基因却异常困难。我们以家蚕为材料开展了如下研究：1.构建了piggyBac转座子随机插入的突变体库，并从中筛选出了一个“薄茧”突变体，该突变体的茧明显变薄，茧成率显著降低。2.鉴定出了5个插入突变基因，包括Glutamyl aminopeptidase (GluAP)和Aquaporin(AQP)。3.GluAP和AQP的表达与丝腺的发育密切相关。通过crispr/cas9获得了缺失GluAP和AQP的家蚕突变体。4.敲除GluAP后，幼虫表皮变得半透明，绝大多数个体在蜕皮过程中死亡；少数发育至末期的幼虫多出一个龄期，并且茧变薄，茧成率显著降低。GluAP突变体后部丝腺中有机氮代谢显著改变。与谷氨酸合成相关的基因GOGAT、GDH、MDH在突变体后部丝腺中显著下调。GluAP抑制剂处理后，家蚕的茧成率明显降低，并且后部丝腺谷氨酸含量显著减少。这表明GluAP可能通过调控丝腺中谷氨酸的合成，从而影响家蚕丝蛋白的产量。5.AQP3缺失突变后，家蚕个体明显变小，茧成率没有显著的改变。但是，同时缺失AQP3和AQP1后家蚕的个体进一步变小，茧成率显著增加。这意味着AQP3和AQP1具有一定的功能互补，两者可能以某种方式影响丝蛋白的产量。AQP3缺失后虫体氧化磷酸化通路发生了显著的上调，氧化磷酸化通路五个复合体中的基因在突变体中都显著高表达，并且突变体中复合物I和复合物III的酶活性显著增强。这些结果说明，AQP缺失显著增强了氧化磷酸化，引起能量的过度消耗，使得营养物质难以积累，最终影响生长发育，导致个体变小。此外，氧化磷酸化增强也可能会影响到丝腺的吐丝功能，从而对丝产量产生一定的影响。以上结果表明，GluAP和AQP都参与调控家蚕的产丝量。此外，我们还发现GluAP参与调控幼虫蜕皮和变态发育，而AQP3能影响家蚕的个体大小发育。该研究结果为家蚕分子育种和害虫防治提供了新的靶标，不仅有利于培育高产的家蚕新品种，还为害虫防治提供了有益的借鉴。