基于ERK1/2/GATA4通路对“气虚血瘀”致心肌缺血再灌注损伤的作用及益气活血中药干预机制研究

Myocardial ischemia and reperfusion injury (MIRI), is a serious risk factor of human health. "Qi deficiency and blood stasis, the context is blocked" is an important pathogenesis of MIRI. Our previous study showed that Yiqi Huoxue drug,Tongguan capsule can reduce MIRI, but the exact mechanism has not been elucidated. In the previous studies, the ERK1/2/GATA4 pathway played an important role in reperfusion injury. We hypothesized that deficiency of Qi and blood stasis, excessive activation of ERK1/2/GATA4 pathway; Tongguan Capsule can inhibit the pathway of ERK1/2/GATA4, reducing myocardial cell apoptosis, so as to improve MIRI. . To prove the hypothesis, we are going to construct the MIRI model of Qi deficiency and blood stasis type by tightening and loosening the coronary artery of 18 months old mice, observing infarction size by Evans blue/TTC staining, calculating heart function by echocardiography, watching myocardial cell apoptosis by tunnel method, ensuring ERK1/2/GATA4 protein expression by Western blotting, detecting the combination of GATA4 with Bcl-2 promoter binding site, and revealing the mechanisms of Tongguan Capsule on MIRI model of Qi deficiency and blood stasis type. This study was undertaken to provide targets and experimental basis for new clinical application of Tongguan Capsule in the treatment of MIRI.

心肌缺血再灌注损伤(MIRI),严重危险人类健康.“气虚血瘀,脉络受阻”是MIRI的重要病机。我们前期研究发现益气活血中药通冠胶囊能改善心肌缺血再灌注损伤，但其确切机制尚未阐明。课题组前期研究发现, ERK1/2/GATA4通路在再灌注损伤中起到重要作用。我们推测“气虚血瘀”，过度激活ERK1/2/GATA4通路；通冠胶囊通过抑制ERK1/2/GATA4通路，减少心肌细胞凋亡，从而改善MIRI。为证实该假说，本研究以18月龄老年小鼠冠脉紧松的方法构建气虚血瘀型MIRI模型，通过心肌切片染色明确心肌梗死，心脏超声明确心功能，Tunnel法检测心肌细胞凋亡，免疫印迹检测ERK1/2/GATA4蛋白表达，EMSA、Chip检测GATA4与凋亡基因Bcl-2启动子结合情况，并且观察通冠胶囊对气虚血瘀型MIRI的作用机制。本研究的开展为通冠胶囊治疗MIRI的临床应用提供新的作用靶点和试验依据。

心肌缺血再灌注损伤(MIRI),严重危险人类健康.“气虚血瘀,脉络受阻”是MIRI重要病机。我们前期研究发现益气活血中药通冠胶囊能改善心肌缺血再灌注损伤，但其确切机制尚未阐明。在本课题研究中,我们购置了18月龄老年C57/BL6J雄性小鼠，予以行MIRI手术，发现TGC能显著改善MIRI，减少心肌梗死面积，改善心功能，抑制心肌细胞凋亡，减少心肌损伤标志物(cTnI)和心室重构标志物(NproBNP)的表达,并且抑制磷酸化ERK的表达。为进一步明确通冠胶囊是否能改善心肌损伤，我们又构建了异丙肾上腺素（ISO）皮下注射导致心肌损伤和心室重构的实验，发现了同样的良好效果，提示TGC通过ERK 通路发挥调节MIRI作用。进一步，我们在活体动物明确TGC抗MIRI的分子机制，我们分别运用了PD98059（ERK1/2特异性抑制剂）、LY294002（PI3K特异性阻断剂）、KN-93（CaMKIIδ特异性blocker），发现ERK1/2被抑制后，TGC对MIRI的梗死面积无显著增加，而给予LY和KN的MIRI均有增加，故运用反问题（inverse problem）的方法，提示P-ERK1/2在TGC改善气虚血瘀型MIRI的分子机制，从而在体内试验通过分子生物学和药理学的方法相结合阐释了机制。此外，我们分离了原代乳小鼠（C57/BL6J）心肌细胞，给予连二亚硫酸钠（Na2S2O2）刺激模拟体外心肌缺血再灌注损伤模型，并予以通冠胶囊含药血清孵育，运用qPCR、Western、ELISA、Tunnel方法，也发现了通冠胶囊能够通过调控P-ERK1/2通路改善MIRI。最后，为了进一步阐释TGC作用于p-EKR1/2 的下游入核基因调控，我们选择了心室重构、心肌损伤经典的核转录因子GATA4，在H9C2 心肌细胞上运用EMSA、Chip的方法，验证了我们的假说。总之，我们的研究结果证实了，“气虚血瘀”，过度激活ERK1/2/GATA4通路；通冠胶囊通过抑制ERK1/2/GATA4通路，减少心肌细胞凋亡、损伤，改善心室重构，从而改善MIRI。本研究的开展为通冠胶囊治疗MIRI的临床应用提供新的作用靶点和试验依据。