灰葡萄孢氧胁迫响应信号通路关键基因的发掘及其功能分析

Botrytis cinerea, the gray mold fungus, infects over 200 cultivated plant species and causes significant economic damage to crops worldwide. Plant pathogens have to cope with oxidative stress conditions from host plants. Therefore many pathogens have evolved oxidative stress response (OSR) mechanisms to scavenge elevated intracellular ROS levels. Up to now, little was known about components and molecular mechanisms OSR system. In this project, we will construct mutant library with promoter trapping vector using Bcgfp1 as reporter gene with enhanced GFP expression in Botrytis cinerea and transform vectors using Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation. First, we will screen the mutants with reporter gene Bcgfp1 and oxidative stress tolerance assay. Then, we will clone flank sequences of T-DNA insertion location and find ORF of insertion inactivated genes. After that, we will research function related genes with an array of molecular technology. Moreover, in order to know whether we the screened genes also related with pathogenicity, we will analyse the screened genes with virlence assay in tomato. Our results make us insight the molecular basis of this disease and develop more efficient strategy to control this pathogen.

灰葡萄孢能在200多种植物上引起灰霉病，每年在生产中造成重大经济损失。氧胁迫响应系统在病原真菌应对来自寄主植物的氧胁迫的过程中发挥了关键的作用。然而，目前对于灰葡萄孢该系统的许多作用元件及分子机制仍所知有限。本研究拟使用以高效表达的Bcgfp1为报告基因的双向启动子捕获载体，通过农杆菌介导的方法建立灰葡萄孢的T-DNA插入突变体库，筛选报告基因表达且氧胁迫耐受性明显差异的突变体。然后利用TAIL-PCR、基因组数据库比对克隆突变基因；依靠基因、蛋白质序列分析，目的基因突变及回补，表达量检测等方法揭示这些基因在响应氧胁迫过程中的作用。另外，有研究发现许多真菌的氧胁迫响应基因同时与致病相关，本研究将对筛选到的突变体进行致病分析，获得致病力明显改变的突变体，并研究其作用机制。本项研究将为更深入地了解灰葡萄孢氧胁迫响应的分子机制奠定基础，并为更有效的防治灰霉病提供理论依据。

灰葡萄孢能在200多种植物上引起灰霉病，每年在生产中造成重大经济损失。在灰葡萄孢与寄主植物互作的过程中，作为早期的一种广谱的和非专化性的防卫反应，植物在侵染位点会产生氧爆发（Oxidative burst），产生大量活性氧（Reactive oxygen species, ROS），灰葡萄孢具有一套有效的活性氧响应和耐受系统以防止被活性氧杀死，并成功的在寄主植物上致病。然而，目前对于灰葡萄孢该系统的许多作用元件及分子机制仍所知有限。本项目构建了在灰葡萄孢中能够高效表达的Bcgfp1为报告基因的双向启动子捕获载体，通过农杆菌介导的方法，成功建立了灰葡萄孢的T-DNA插入突变体库，产生了大约1100个突变子。之后以报告基因绿色荧光蛋白Bcgfp1和H2O2平板的耐受性差异性最终筛选到了2个目标突变子。然后，利用TAIL-PCR、基因组数据库比对、基因和蛋白质序列分析，目标基因敲除及基因回补，高通量测序和表达量检测等方法揭示这些基因在灰葡萄孢响应氧胁迫过程中的作用。本项目（1）构建了能够在灰葡萄孢上使用的双向启动子捕获载体P1300-trap，并利用报告基因Bcgfp1进行高通量的筛选氧胁迫响应基因；（2）建立了成熟稳定的基因敲除，回补等一系列基因功能研究方法。本项目通过建立的筛选方法，找到了2个氧胁迫响应基因，并进行了功能分析，为更深入地了解灰葡萄孢氧胁迫响应的分子机制，揭示其调控的信号网络，并为将来更有效的防治灰霉病提供理论依据。