不结球白菜BcWRKY1转录因子抗霜霉病功能研究

The WRKY transcription factors are most important family transcription factors of plant in response to pathogen, with roles in disease resistance and signal transduction pathways. We obtained the BcWRKY1 transcription factor gene using the cDNA-AFLP in non-heading Chinese cabbage, which is responsive to downy mildew. We found that BcWRKY1 is an early responsive gene to downy mildew, but its DNA binding properties, functions and regulation mechanism in disease resistance are not clear. The project will analyze the function of BcWRKY1 in downy mildew resistance by using over-expression transgenic plants and RNAi silencing plant, and identify proteins which interact with the WRKY transcription factor by using the yeast two-hybrid system and BiFC technology. The results will not only help elucidate the resistance mechanism to downy mildew in non-heading Chinese cabbage, but also help promote the process of molecular breeding in antidisease.

WRKY转录因子是植物响应病原菌胁迫最重要的转录因子之一，参与抗病反应及信号传导通路的调控。项目组前期已利用cDNA-AFLP技术获得了一个不结球白菜响应霜霉病胁迫的BcWRKY1转录因子，并发现BcWRKY1属于不结球白菜对霜霉病菌早期应答的基因，但其结合特性、抗病功能及调控机理尚不明确。本项目拟采用转基因技术对高感材料进行BcWRKY1过量表达和对高抗材料进行RNAi抑制表达，对BcWRKY1抗病功能进行分析，并利用荧光定量PCR技术分析BcWRKY1转录因子对PR等防御反应基因表达的影响；同时，利用酵母双杂交等技术筛选BcWRKY1互作蛋白，并利用BiFC等技术对其互作进行验证，探讨BcWRKY1转录因子在不结球白菜抗霜霉病反应中的抗病功能及调控机理。通过本研究，不仅有利于阐明不结球白菜抗霜霉病的分子机制，还有利于推动不结球白菜抗霜霉病分子育种进程，具有重要的科学意义和应用前景。

本研究在分离获得应答不结球白菜霜霉病胁迫的BcWRKY1 cDNA全长的基础上,分析 了BcWRKY1对W-box、PRE4、SURE和WK-box等顺式作用元件的结合特性和转录激活能力, 进而获得不结球白菜BcWRKY1转录因子的作用特点。通过过量表达和RNAi技术分析BcWRKY 1介导的不结球白菜对霜霉病抗性及相关防御反应基因表达的影响,阐述BcWRKY1转录因 子在不结球白菜抗霜霉病反应中的抗病功能。利用酵母双杂交技术获得与BcWRKY1互作的 基因,通过免疫共沉淀和BiFC技术在体外和体内对二者的互作进行验证;通过亚细胞定 位分析,确定BcWRKY1转录因子与互作基因在细胞中的作用部位,探讨BcWRKY1转录因子 在不结球白菜抗霜霉病反应中的调控机理。此外，采用优化了的双向电泳技术，结合基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI-TOF/TOF MS）技术，研究了不结球白菜在霜霉菌胁迫下的蛋白质组变化。共鉴定到91个差异蛋白点，并构建了不结球白菜与霜霉病菌互作模式图：在霜霉病胁迫下，不结球白菜通过增强乙烯合成能力和能量供应、平衡活性氧产生与消除、增强蛋白代谢和光呼吸、降低光合作用及诱导光修复等途径增强抗病性。对相关蛋白进行pathway通路分析，发现8个蛋白参与乙烯合成，且蛋白丰度均有显著上升，结合荧光定量分析与乙烯含量测定，发现乙烯在不结球白菜抗霜霉病菌胁迫中可能起正调控作用。