铜绿假单胞菌胞外多糖Psl和第二信使c-di-GMP交互调控的分子机理

Exopolysaccharide is a critical biofilm matrix component of many Gram-positive and -negative bacteria. In the opportunistic pathogen Pseudomonas aeruginosa, Psl polysaccharide (the product of polysaccharide synthesis locus) is a primary scaffolding component of biofilms and promotes bacterial cell-cell and cell-surface interactions by acting as “molecule glue”. It can also play a signaling role to stimulate the production of bacterial second messenger cyclic di-GMP (c-di-GMP) and ultimately enhance the biofilm matrix production including itself. However, the regulatory mechanisms of Psl polysaccharide acting as a signal to stimulate c-di-GMP production remain poorly understood in details. The current results in our lab showed that some gene mutants of psl operon responsible for the Psl polysaccharide synthesis still produced some Psl polysaccharide, but these Psl polysaccharides could not stimulate c-di-GMP production. To this end, the aim of this proposal is to investigate the molecular structure basis of Psl polysaccharide as a signal and then illustrate how Psl polysaccharide and c-di-GMP regulate each other’s synthesis. A regulation-based understanding of the mechanisms about the Psl polysaccharide synthesis will lead to better understanding how polysaccharide plays a role as a signal in bacterial regulation, and also provide us strategies to control biofilm-related complications in clinical settings and improve the quality of life for patients who suffer from biofilm-related infections.

在条件致病菌铜绿假单胞菌生物被膜发育过程中，胞外多糖Psl起着至关重要的作用，该多糖是维持生物被膜结构的主要骨架物质，并且能够作为信号分子促进胞内第二信使c-di-GMP的合成，从而增强包括其自身在内的胞外基质的合成。然而，直到目前为止，Psl如何作为信号促进c-di-GMP的合成以及c-di-GMP如何反馈增强Psl的合成机制仍不明晰。本研究组近期发现，一些Psl胞外多糖合成相关基因缺失突变株仍能合成Psl胞外多糖，但此种Psl多糖却失去了信号分子的功能。本项目拟在此基础之上，进一步通过生物化学、分子生物学与遗传学等方法解析Psl胞外多糖作为信号分子的结构基础，阐明Psl胞外多糖和c-di-GMP促进彼此合成的分子机制。项目的完成将会增强对细菌胞外多糖作为生物学信号功能的理解，深化对胞外多糖和c-di-GMP合成调控的认识，同时为防治生物被膜感染药物靶标的设计提供理论基础。

铜绿假单胞菌是一种革兰氏阴性条件致病菌，极易感染囊性纤维化患者和免疫缺陷病人，感染之后，能够形成生物被膜，导致菌体耐药性的增加和治疗的困难。在铜绿假单胞菌生物被膜发育过程中，胞外多糖Psl起着至关重要的作用，它是铜绿假单胞菌生物被膜结构的主要骨架物质，并且能过作为信号分子促进胞内二级信使的合成，从而增强包括其自身在内的胞外基质的合成。本项目首先重点阐明了参与Psl合成关键蛋白的作用。研究发现，Psl合成过程中的关键蛋白PslG是一个糖苷水解酶，能将Psl多糖水解为寡糖，包括八糖、六糖、三糖和二糖。PslG可定位于细胞的内膜和周质空间，它在细胞膜上的定位参与了Psl多糖典型丝状结构的形成，而周质空间PslG的增加会导致Psl多糖产量的减少。细菌双杂结果显示PslA，PslD和PslE均与PslG有直接的相互作用，它们帮助PslG锚定在内膜上。此外，报告菌株荧光信号检测Psl多糖的信号发现，pslG缺失突变株的Psl多糖产量比PAO1减少了近70 %，但是信号作用却不受影响，暗示非降解的Psl胞外多糖具备更强的信号分子活性。另外，研究发现ΔpslB产的Psl多糖没有信号作用，说明PslB 涉及Psl 信号关键位点的合成。突变菌株ΔpslK和ΔpslL能够合成少量的Psl多糖，但ΔpslK产的Psl多糖有信号作用而ΔpslL产的Psl多糖却没有信号作用；进一步的研究发现PslL是一个乙酰转移酶，因此，Psl多糖乙酰基的修饰是Psl多糖发挥信号作用的关键因素之一。此外，利用Sephadex G-50层析柱对Psl多糖粗提物进行分离后，检测不同分子量大小的Psl的信号功能，结果发现只有高分子量（大于5个五糖重复单元）的Psl多糖才有信号作用。总之，我们的结果阐明了参与Psl合成过程中关键蛋白的作用以及涉及Psl信号作用形成的分子机制，对于开发基于Psl合成的药物靶点提供了一定的理论基础。