基于细胞自噬分子调控的大麦广谱抗病新机理及其种质创制研究

The aim of the present proposal is to promote breeding resistant barley, reducing pesticide residue and ensuring food safety. In this proposal, on the basis of the results obtained in our previous studies, we will (1)investigate expression of HvATG8s in barley when pathogens infected; (2) clone genes whose expressions have significantly changes; (3) examine cellular localization of HvATG8s expression and identification of pathogen-induced expression in barley; (4) confirm the pathogens infection affect autophage; (5) select the interaction proteins by TAP technology with HvATG8-A as bait,; (6) examine the proteins which have function in the autophage regulation and resistance to pathogens in barley; (7) with gene clone, protein localization and barley transformation of over-expression and interference, confirm their roles in autophage regulation and resistance to pathogens in barley. Finaly, clarify the mechanism of resistance to pathogens on autophage molecular regulation, and provide a new way to genetic improve the resistance to multiple pathagens in barley.

培育广谱抗病性品种，可以降少农药使用，提高其食品安全性。本项目以大麦青稞为研究对象，在已取得相关结果基础上，进行（1）大麦细胞自噬- - 溶酶体标记的关键蛋白HvATG8s的同源比较；（2）检测确定大麦HvATG8s的mRNA在病原体侵染下的变化，并克隆关键的大麦ATG8s基因（HvATG8-A）；（3）确认HvATG8-A的表达受病原体侵染的诱导，并确定大麦免疫反应的可靠表型,定位HvATG8-A的表达部位；（4）以HvATG8-A作为诱饵蛋白，利用TAP技术分离纯化与其互作的目标蛋白；（5）克隆关键的蛋白基因，并确定其亚细胞定位；（6）研究确定关键蛋白对细胞自噬途径及大麦免疫机制的调节作用。（7）筛选一批过量表达或者干涉的后代株系，鉴定分析抗性。最后证实该蛋白在细胞自噬途径和大麦抗病中的作用。阐明一种"基于细胞自噬分子水平调控的大麦广谱抗病新机理及其种质创制新途径"。

自噬是真核生物细胞中一种进化保守的生理过程，其相关蛋白调控自噬小体发生。拟南芥、水稻、小麦等研究表明，ATG6、ATG8及其自噬功能与植物抗胁迫和病原侵染引起的免疫反应相关。自噬蛋白功能研究不仅促进对自噬分子机制认识，而且可用于抗性改良。本项目以大麦为材料，用同源蛋白搜索，基因克隆，序列分析，亚细胞定位，功能互补，表达分析和基因瞬时沉默，研究大麦自噬功能。主要结果如下：（1）大麦自噬蛋白的筛选和序列分析：以拟南芥水稻ATG6、ATG8为参照，搜索筛选得到大麦同源蛋白，命名为HvATG6和HvATG8。通过序列比对、功能结构域和进化树分析，发现与小麦水稻同源蛋白相似度分别达90%和70%。HvATG6含β-折叠-α-螺旋自噬功能结构域，暗示具自噬功能。（2）大麦自噬蛋白细胞定位：在大麦原生质体中转化表达N端GFP融合的HvATG6、HvATG8蛋白，发现均定位在细胞质，能形成类似自噬小体前体结构。（3）大麦自噬蛋白在酵母atg6突变体中功能互补研究：将HvATG6在酵母atg6突变体中表达，氮源营养缺陷处理，发现该酵母突变体可重新出现类似自噬小体结构，说明其可弥补酵母ATG6突变引起的自噬功能缺陷。（4）HvATG6表达研究：野生型大麦在高盐、干旱、冷、氮源缺陷和铝毒等多种胁迫下，幼苗HvATG6表达比对照明显上调。其中铝毒胁迫下HvATG6的表达变化最大，敏感品种幼苗分别在10或30μM Al3+处理72h，根中HvATG6的表达均为正常培养的4倍以上；10μM Al3+处理4h后HvATG6的表达只在根尖处有明显上调，表明HvATG6表达与胁迫反应有关，自噬具帮助大麦抵抗外界胁迫的功能。（5）HvATG6瞬时沉默大麦株系对胁迫影响研究：通过大麦条纹花叶病毒介导大麦基因沉默实验，得到新叶中ATG6表达明显下降的大麦植株。分别在黑暗或氧化胁迫处理，结果表明，与γ空载对照相比ATG6表达下调的植株离体叶片出现更强的黄化，说明胁迫给HvATG6基因沉默的叶片造成更大影响。本研究证明大麦存在类似ATG6、ATG8自噬同源蛋白，定位于细胞质。其表达与胁迫有关，调控其表达对改良大麦抗性具有重要意义，为深入探究自噬基因功能奠定了基础。