Tollip通过中性粒细胞调控炎症性肠病肠黏膜损伤和修复的作用机制研究

Abnormal immune responses in intestinal mucosa toward commensal bacterial flora may be associated with the etiology and pathogenesis of human IBD. The Toll-interacting protein (Tollip) is a critical negative regulator of Toll-like receptor (TLR)-mediated innate immune responses. Our recent studies showed Tollip expression is reduced on neutrophils and intestinal mucosa from patients with active IBD; Tollip deficiency drives inflamed yet incompetent neutrophils and fails to produce mediators related to mucosal repair in DSS induced colitis in mice, which leads to more serious mucosal injure and delays mucosal repair. These results indicate that deficiency of Tollip contributes to the progress of colitis,suggesting that up-regulation of Tollip may restore neutrophil immunological function and play an important role in the prevention and treatment of IBD. In this study, we will further investigate the immunological functions of neutrophil in DSS induced colitis in mice by targeting up-regulation of Tollip with nanoparticle BSA-Chit-Tollip. This work will determine the potential role of Tollip in the pothogenesis of IBD and explore whether Tollip could be a new target for accurate diagnosis and treatment and prognosis evaluation of IBD.

炎症性肠病（IBD）的发生与肠黏膜免疫对肠道微生物产生过激的免疫应答等因素相关，Tollip是TLRs介导的肠黏膜免疫反应中重要的负性调控因子。我们前期研究发现，活动期IBD患者外周血中性粒细胞及病变部位肠黏膜Tollip表达降低；DSS诱导的Tollip基因敲除小鼠结肠炎模型中，中性粒细胞免疫活性下降，肠黏膜损伤加重及修复延缓。表明中性粒细胞Tollip表达下调与IBD发病相关，提示上调Tollip表达可能恢复中性粒细胞免疫学功能，并可能在预防和治疗IBD中发挥重要作用。本项目将在前期研究基础上，以基于纳米技术构建的纳米微粒BSA-Chit-Tollip在小鼠体内靶向上调中性粒细胞Tollip表达，研究上调Tollip表达对中性粒细胞免疫学功能的调节作用机制以及进一步对DSS诱导的小鼠结肠炎发挥预防和治疗作用机制，为探讨Tollip能否成为IBD临床精准诊断和治疗的新靶点提供坚实的依据。

先天性免疫失调和黏膜修复受损是炎症性肠病（IBD）的两个重要病理生理特征，虽然众多治疗策略被频繁用于临床治疗，但IBD的治疗仍是一个挑战。IBD患者结肠组织中有大量巨噬细胞，他们在炎症的启动和消退中起着重要作用，调控巨噬细胞极化是治疗炎症性肠病的一种有前途的策略。Tollip是Toll样受体（TLR）介导的天然免疫的重要负性调控因子。课题组前期研究发现Tollip在IBD患者结肠组织中表达下调。本项目旨在通过纳米载体递送Tollip基因至肠道巨噬细胞进而调控巨噬细胞极化，构建一种分子靶向免疫治疗方法，为IBD的治疗提供新的候选策略。首先，通过构建甘露糖修饰三甲基壳聚糖（MTC）的纳米复合物包裹Tollip表达的质粒，形成具有靶向功能的MTC-Tollip纳米颗粒。通过粒度等检测，MTC-Tollip纳米颗粒粒径分布均一，无明显细胞毒性，稳定性良好。免疫荧光和PCR检测表明MTC-Tollip可以靶向到肠道巨噬细胞且上调肠道Tollip mRNA表达。其次，我们发现用3%DSS诱导小鼠肠炎模型，给予MTC-Tollip灌胃治疗，结果表明与DSS模型组相比，MTC-Tollip纳米颗粒治疗缓解IBD症状。PCR和免疫组化染色检测肠道组织紧密连接蛋白表达，结果表明MTC-Tollip治疗保护了肠道屏障。肠道免疫组化染色和免疫荧光结果表明经MTC-Tollip治疗降低了肠道组织中M1型巨噬细胞，升高了M2型巨噬细胞。体外过表达巨噬细胞Tollip，LPS刺激，流式检测M1型巨噬细胞阳性率，此外，发现过表达Tollip可以通过降低NF-κB的转录抑制巨噬细胞M1型极化。IL-4刺激，我们发现过表达Tollip通过协同AKT活化促进了IL-4刺激的M2型极化。用Tollip敲除小鼠的腹腔巨噬细胞进一步实验，结果表明Tollip缺失加重LPS刺激的M1型巨噬细胞极化，降低了IL-4刺激的M2型极化。结果发现MTC-Tollip靶向递送至肠道巨噬细胞并上调Tollip表达；MTC-Tollip纳米颗粒可以通过降低肠道组织中M1型增多M2型巨噬细胞，有效缓解结肠炎；在体外，Tollip通过负调控TLR信号通路，降低NF-κB活化，抑制巨噬细胞M1极化。 Tollip通过上调AKT的磷酸化，促进IL-4刺激巨噬细胞M2极化。巨噬细胞中Tollip表达的调控可能是治疗IBD的一种新方法。