乳酸菌对乳源短链脂肪酸吸收的调控作用及其机制

Short chain fatty Short chain fatty acids (SCFAs) have a wide range of physiological and biological effects, which are the important information molecules in the interaction between intestinal microflora and host, the absorption of SCFAs are inhibited when the intestinal microflora imbalance. Studies have shown that this inhibition could be attenuated and the absorption of SCFAs of host would be improved by Lactic acid bacteria (LAB). SCFAs in milk have become an important source of SCFAs that human needs with the consumption of milk and dairy products continue to increase. Therefore, Caco-2 and IEC-6 cell monolayers are infected by pathogenic Escherichia coli, and SCFAs in milk is labeled by 14C isotope so as to establish the inhibition model of intestinal epithelial cells absorb SCFAs in milk. The promoting effect of LAB on cells absorb SCFAs in milk are discussed according to adjust the MCT1 and SMCT1 carrier protein of SCFAs transporters, and the ligand protein of SCFAs transporters in LAB surface protein are screened and identified by Protein Cross-linking, Western-blot and other technologies. Moreover, the regulation effect of ligand protein on the expression, driving force and signal pathway of SCFAs transporters are further studied by means of qRT-PCR, Cell Surface Biotinylation and other technologies in order to clarify the mechanism of LAB regulate the absorption of SCFAs in milk of epithelial cells.

短链脂肪酸（SCFAs）具有广泛的生理活性和生物学效应，是肠道菌群和宿主之间相互作用的重要信息分子，当肠道菌群失衡时，SCFAs的吸收会受到抑制。有研究表明，乳酸菌能够解除这种抑制作用并促进宿主吸收SCFAs。而随着乳与乳制品消费量的不断增加，乳源SCFAs已成为人体SCFAs的重要来源，因此，本项目利用14C同位素标记乳源SCFAs，通过致病性大肠杆菌感染Caco-2、IEC-6单层细胞，建立抑制肠上皮细胞吸收乳源SCFAs模型，探讨不同乳酸菌通过调节SCFAs转运体MCT1和SMCT1载体蛋白来促进细胞对乳源SCFAs的吸收作用；并进一步利用蛋白质交联、Western-blot等技术筛选、鉴定乳酸菌表面蛋白中SCFAs转运体的配体蛋白，通过qRT-PCR、细胞表面生物素化等技术探究配体蛋白对SCFAs转运体的表达、驱动力及信号途径的调控作用，阐明乳酸菌调控乳源SCFAs吸收的作用机制。

乳酸菌在调节机体吸收短链脂肪酸（SCFAs）的过程中发挥着重要作用。项目通过肠道应激、黏蛋白和Caco-2细胞黏附等试验从实验室保藏的乳酸菌中筛选出黏附能力较强的菌株；然后通过跨膜电阻值（TEER）、苯酚红通透量（Papp）、细胞超微结构等来评价Caco-2细胞吸收乳源SCFAs模型的完整性和稳定性；并利用三重串联四级杆气质联用仪来建立细胞内乳源SCFAs的测定方法。最后研究乳酸菌对Caco-2细胞的SCFAs转运体表达水平的调控作用。结果表明，P1、P67、P58、P128等18株乳酸菌在依次经过pH 3.0人工胃液和0.3%胆盐的人工肠液后的存活率均大于10%；其中菌株P1、P54、P58、P67、P97、P123、F146及P198对黏蛋白和Caco-2细胞的黏附率均大于30%，且耐药性较低；经API和16S rDNA鉴定，菌株P1、P54、P58、P67、P97、P123及P198为植物乳杆菌，F146为发酵乳杆菌。将1.2×105 cells/mL的Caco-2细胞悬液接种于Transwell板上，培养7-15天后的TEER值均稳定在1000 Ω·cm2以上，且Papp值小于1×10-6 cm/s，细胞间形成紧密连接及微绒毛结构，当模型中丙酸和丁酸的浓度为1 mM时，Caco-2细胞存活率大于91%，表明该细胞模型建立成功。SCFAs标品溶液的相对标准偏差值（RSD）低于5%，线性良好，丙酸和丁酸质控样本的RSD小于10%，表明建立的方法可用于丙酸和丁酸含量的测定。接种植物乳杆菌P54、P58、P67、P97、P123、P198的Caco-2细胞单层模型中丙酸含量均显著高于未接菌（p＜0.05），而接种发酵乳杆菌F146和植物乳杆菌P1的Caco-2细胞单层模型中丁酸含量均显著高于未接菌（p＜0.05）；同时，植物乳杆菌P1、P54、P58、P97、P198和发酵乳杆菌F146显著上调了Caco-2细胞MCT1的相对表达量（p＜0.05），而植物乳杆菌P54、P58、P67、P97、P123、P198则显著上调了SMCT1的相对表达量（p＜0.05），表明乳酸菌可以通过调控Caco-2细胞中SCFAs的转运体表达水平来促进其对SCFAs的吸收。项目的研究为具有促肠上皮细胞吸收SCFAs和其他活性物质的功能益生菌筛选及其发酵乳制品的开发应用提供理论依据。