Rock-Drp1/Opa1调控的线粒体动态变化对肺癌侵袭和转移的影响及相关机制研究

Mitochondria are highly dynamic organelles that can form a network structure in cells via continuous fusion and fission. Drp1 and Opa1 are participated in the regulation of mitochondrial fission and fusion respectively. Our previous research shows that CXCL12 can enhance the ability of invasion and chemotaxis of A549 lung cancer cells, while making the distribution of the mitochondria in cells present obvious polarity changes. However, this phenomenon doesn't happen to ρ0 A549 cells (A549 cells without mitochondrial genome). Recently, we used a lentiviral overexpression vector to construct overexpression of Drp1 (Lv-Drp1), Transwell and cell wound scratch assay showed overexpression of Drp1 obviously enhanced the abilities of invasion and migration of A549 lung adenocarcinoma cells, suggesting that Drp1 may be involved in the invasion and migration of lung cancer cells (unpublished). A recent study on diabetic nephropathy found that Rock1 could induce mitochondrial fission by phosphorylating Drp1 and subsequently regulate mitochondrial dynamic system. To date, Rock1 is the most important Rho related protein kinase involved in the process of tumor invasion and metastasis. Thus we speculated that mitochondrial morphological changes and resultant network distribution regulated by Rock-Drp1/Opa1 might be involved in invasion and metastasis of lung cancer cells. In order to illustrate the concrete mechanisms and role of Rock1-Drp1/Opa1 in the invasion and metastasis of lung cancer, this project will be carried on by using gene silencing and overexpression methods in vitro tumor cells and in vivo transplantation animal model.

线粒体是一种高度动态变化的细胞器，Drp1和Opa1分别参与调控线粒体的分裂和融合。我们前期研究发现，CXCL12在增强A549肺癌细胞侵袭和趋化性的同时，可使细胞内线粒体的分布呈明显的极性化改变，而这一现象并未发生在ρ0A549细胞。最近我们研究发现，A549细胞过表达Drp1后其侵袭和迁移性得到明显增强，提示Drp1/Opa1可能参与肺癌细胞的侵袭和迁移。近期一项针对糖尿病肾病的研究显示，Rock1可通过磷酸化Drp1诱导线粒体分裂，调控线粒体的动力学系统。而Rock1是目前已知参与肿瘤侵袭和转移过程最重要的Rho相关蛋白激酶。我们推测Rock1可能通过调控Drp1/Opa1引发线粒体形态学及细胞动力学变化，参与肺癌侵袭和转移。为此，本研究拟采用RNAi和基因过表达等技术方法，通过体外细胞学和移植瘤动物实验深入研究假定的Rock-Drp1/Opa1通路与肺癌侵袭和转移的关系及作用机制。

肺癌是我国和世界上最常见的恶性肿瘤，也是癌症相关死亡首要疾病。肺癌初诊时约2/3已经失去了手术机会，转移是其最重要的生物学行为，也是其致死的主要原因。转移的机制涉及癌细胞的黏附、细胞外基质的降解和癌细胞的迁移和运动等方面，具有相当的复杂性，目前仍有许多问题尚不清楚。线粒体失衡的分裂和融合会导致细胞生长调节失控。我们前期研究发现，癌细胞内线粒体的动态分布与癌细胞的侵袭和趋化可能相关。因此本项目研究重点研究线粒体动力学相关蛋白Drp1（dynamin-related protein 1）调控的线粒体动态改变对肺癌细胞侵袭和转移的影响。.为实现上述研究目标，我们通过慢病毒介导的RNAi和基因过表达技术将shDrp1和Lv-Drp1分别转染不同肺腺癌细胞株（95D和A549），建立稳转细胞株。随后利用MTT法检测细胞活力，细胞克隆实验评估慢病毒感染后细胞的成瘤能力；利用细胞侵袭实验和细胞划痕实验分别检测慢病毒感染后细胞侵袭力和迁移率；并通过Annexin V-APC单染法检测细胞凋亡率。进而明确Drp1对肺癌细胞侵袭和转移的影响。结果发现，对于肺腺癌95D细胞，Drp1基因过表达后细胞增殖率显著增高；敲除后细胞增殖率和克隆数显著降低。对于A549肺腺癌细胞，与95D不同的是，敲除Drp1后肺癌细胞的侵袭转移率较对照组显著下降25%。划痕24小时后，敲除组细胞的迁移率较对照组显著下降10%，而过表达Drp1后细胞迁移率显著升高。.通过上述研究结果，我们首次发现，Drp1调控线粒体分裂动态分布与肺癌细胞的侵袭和迁移相关。Drp1活性的上调导致线粒体分裂，抑制或下调Drp1可以引发高度交织的线粒体网状结构的形成。不同肺腺癌细胞，Drp1敲除均能够显著降低细胞增殖和克隆形成。重要的是，A549细胞在Drp1敲除后，细胞的侵袭转移和迁移率明显下降，而过表达Drp1则使细胞迁移率显著升高。提示线粒体分裂蛋白Drp1与肺腺癌的增殖，侵袭和转移有关。未来通过抑制Drp1信号通路将有助于肺癌等抗肿瘤治疗。建议针对Drp1上游调控信号通路进行深入研究。