基于转录组的藏药藏茵陈川西獐牙菜（口山）酮生物合成关键酶基因研究

Zangyinchen is one of the eight treasure in Tibet medicine in Tibetan Plateau. It is the most special one and commonly used in clinical treatment of Hepatology. Swertia mussotii, Tibetan name Santee or Dida, which belong to Gentianaceae Swertia, are genuine Zangyinchen. Due to the long-term excavation, the resources of the wild Zangyinchen were dropped. Based on the results of National Natural Science Foundation (30701138) and China Postdoctoral Science Foundation (20110490556), it showed that Swertia mussotii contained xanthone which has a clear role in protecting liver injury. It also showed that 3 - hydroxy - benzoate: coenzyme A ligase gene, benzophenone synthase gene, and xanthone synthase plays a key role in xanthone biosynthesis. In this study, 3 - hydroxy - benzoate: coenzyme A ligase gene, benzophenone synthase gene and xanthone synthase will be cloned based on Swertia mussotii transcriptome sequencing.By prokaryotic and eukaryotic expression the three enzyme catalytic properties will be analysis based n the national pharmaceutical basis of theory, medicinal chemistry, transcriptional genomics research. This project will lay a foundation to get lots of xanthone through genetic engineering methods in vitro transformation of the enzyme, by screening to get efficient production xanthone engineering bacteria, to meet human demand for natural medicine sources growing in Zangyinchen in the future.

藏茵陈是青藏高原中藏药八珍之一，是藏药中最具特色的治疗肝胆病的临床常用药物。川西獐牙菜藏药名-桑蒂/蒂达，龙胆科獐牙菜属，是藏茵陈的正品，由于长期采挖野生藏茵陈使其资源量锐减。基于国家自然基金（30701138）和中国博士后基金（20110490556）研究基础上发现，川西獐芽菜所含??（口山）酮类成分具有明确的保护肝损伤的作用，有研究表明3-羟-苯甲酸：辅酶A连接酶基因、二苯甲酮合成酶基因以及??酮合成酶起到关键作用。本课题将在民族医药基础理论、药物化学、转录组学研究和酶蛋白催化活性检测的基础上，通过前期研究工作积累的实验资料，进行藏茵陈川西獐牙菜的转录组测序，克隆得到3个酶基因，通过原核和真核表达分析3个酶的催化特性以及在??酮生物合成路径中的作用。本项目为将来通过基因工程的方法进行酶的体外改造，筛选获得高效生产??酮的工程菌，满足人类对藏茵陈天然药源日益增长的需求奠定理论基础。

藏茵陈是青藏高原中藏药八珍之一，是藏药中最具特色的治疗肝胆病的临床常用药物。川西獐牙菜藏药名——桑蒂/蒂达，龙胆科獐牙菜属，是藏茵陈的正品。川西獐牙菜富含大量的活性成分，比如黄酮、口山酮及其苷、环烯醚萜及其苷等，具有明确的保肝、抗癌、抗炎等效果。本项目对四川阿坝州、青海玉树州的川西獐牙菜进行了资源调查，采集了川西獐牙菜用于分子生物学实验、遗传多样性分析和化学成分检测。选取3株来自青海仲达乡的川西獐牙菜，分别提取根、茎、叶和花的RNA，构建文库，利用illumina第二代高通量测序平台对12个组织进行100bp双端测序。获得了1,195,207,248 序列，组装获得98, 613个contigs，N50为1,085 bp。通过Blast与数据库进行比对，35,029个（35.52%）转录本被GO和KEGG注释。通过转录组测序分析发现27个转录本属于黄酮生物合成路径中5个关键基因，其中CHS、FNSII和FLS基因具有完整的开放阅读框。构建CHS和FNSII基因的原核表达载体并成功表达。对FNSII进行活性检测发现其具有生物学功能。通过荧光定量PCR检测CHS、FNSII和FLS基因，发现基因的组织差异性表达非常明显。同时发现39个转录本属于环烯醚萜生物合成路径中的24个酶基因，分别存在于环烯醚萜的3个生物合成阶段MVA甲羟戊酸途径、质体赤藓糖磷酸酯途径MEP和裂环环烯醚萜合成路径secoiridoid。挑选下游7个基因G10H、IS、IO、7DLGT、DL7H、SLS1和SLS2进行荧光定量PCR验证发现，除了7DLGT和SLS2基因外，其他5个基因在叶中表达量较高，与转录组差异表达结果一致。通过对川西獐牙菜口山酮和环烯醚萜类成分的测定我们发现，有效成分主要集中分布于花中，在根中最少。推测可能存在着在叶中合成的有效成分转移到花中的机制。本研究对川西獐牙菜活性成分生物合成路径的基因进行了多方位的了解，并获得了大量的基因序列，为后续体外生物合成活性成分奠定了重要的基础。通过对土壤营养元素和微生物多样性的了解为川西獐牙菜的引种栽培可持续发展提供科学依据。