可人工控制的假单胞菌工程菌株研制与应用

因极强的环境适应能力和独特的代谢途径，假单胞菌已成为生物防治和环境生物修复的候选菌株，美国FDA也已将荧光假单胞菌列为可进行田间释放的环境友好菌株。虽然很多假单胞菌有生物防治和/或生物修复的功能，但因具有潜在的或明显的生物安全风险而无法进行环境释放。即使是FDA批准可使用的荧光假单胞菌，也未能排除其长期使用可能导致的环境污染风险。因此，研制可人工控制的假单胞菌株是控制假单胞菌环境污染、扩大假单胞菌应用范围的关键。本项目的主要研究内容是利用我们建立的重组酶诱导的基因敲除系统，研制L-阿拉伯糖致死的假单胞菌工程菌株；测试这类工程菌株在不同环境中的生存状态、代谢能力、以及L-阿拉伯糖诱导致死的效率。本研究的成功将有利于增加可进行野外释放的假单胞菌株系，消除假单胞菌野外释放的潜在污染。

假单胞菌是生物防治和环境生物修复的候选菌株，具有重要的理论与实际应用价值。但因假单胞菌本身具有潜在的或明显的生物安全风险，现仍难于进行安全的大规模环境释放与应用。因此，研制可人工控制的假单胞菌株是控制假单胞菌环境污染、扩大假单胞菌应用范围的关键。本项目的主要研究内容是利用我们建立的重组酶诱导的基因敲除系统，研制L-阿拉伯糖致死的假单胞菌工程菌株；测试这类工程菌株在不同环境中的生存状态、代谢能力、以及L-阿拉伯糖诱导致死的效率。结果显示，我们成功构建了三种假单胞菌工程菌株，其染色体上均整合了受L-阿拉伯糖操纵子调控的FLP重组酶基因，同时其必需基因dnaE两侧均带有正负筛选标记基因和两个FRT位点。所有整合基因均可以正常转录与表达，菌株的生长代谢正常。实验室培养条件下的测试结果显示三种工程菌株的生长代谢情况正常，与野生型差别不大；利用0.2％L-阿拉伯糖在基本培养基中连续诱导三小时，可诱导细胞发生高效持久的必需基因敲除反应，其细胞致死效率高达98％；无诱导物加入时，则不会诱导细胞致死现象。不同环境条件模拟测试的结果显示，三种工程菌株均在土壤环境和植物根际的生长情况好于淡水环境，其环境中的生长速度比实验室培养条件缓慢，增长速度受环境营养条件、环境温度及离子强度等影响。在土壤环境和植物根际环境下，三种工程菌株均可较正常生长并相对长期存在；一段时间培养后，可逐渐成为环境中的相对优势菌株并向周围迁移，但不影响原有环境中的微生物菌株生长。细胞存活测试结果显示，在土壤和植物根际环境下，中低浓度的L-阿拉伯糖可实现高效的细胞致死效果，其效率与实验室条件下的效率基本相当；而在水体环境中则需略高诱导物浓度才可实现。因此，所构建的工程菌株可被阿拉伯糖有效致死，具有较高生物安全性，可用于环境释放。目前，国内外尚无类似的研究报道。本研究的成功可消除假单胞菌的环境威胁，提高其生物安全性，增加可进行野外释放的假单胞菌株系。后续我们将继续构建的工程菌株进行野外释放，测定其生长代谢与环境安全性等；同时，将该系统整合到环境污染物高效降解假单胞菌菌株，实现安全可控的环境污染物分解与环境修复。