钾离子通道KCNAB介导麝香草酚诱导黄曲霉菌孢子细胞凋亡的分子机制

Aspergillus flavus can contaminate agricultural products, food and feed commodities to cause severe economic loss. It’s also a severe problem threatening public health due to the production of mutagenic and cancerogenic mycotoxins and direct infection in human leading to aspergillosis disease by A. flavus. Efficient drugs and fungicides are expected to be developed to directly control the infection of A. flavus. Our study showed thymol induced the condial apoptosis of A. flavus. Through molecular simulations, it was speculated that thymol target KCNAB, damage mitochondria, and lead to the condial apoptosis. In this study, the interaction between KCNAB and thymol will be studied by monitoring the changes of K+ current potential through patch clamp; the sites of KCNAB deciding the interaction will be confirmed by the specific point mutantion; the release of cytochrome c and Aif will be investigated by western blot; the roles of KCNAB、Aif、caspase 9 and caspase 3 in the condial apoptosis by thymol will be determined by specific gene knockout mutation, and then the apoptosis pathway will be build. Understanding the mechanism underlying the condial apoptosis of A. flavus by thymol will theoretically support the application of thymol in the control of contamination by A. flavus, provide the potential targets for the development of novel drugs against A. flavus or other fungi pathogens, and contribute to new thoughts on breeding new variants resistant to A. flavus.

黄曲霉菌能污染农产品、食品和饲料等造成重大经济损失，同时又能产生毒素致癌致突变或者是直接侵染人类导致曲霉病。直接控制黄曲霉感染最直接有效，但需要高效药物。申请者发现麝香草酚能够诱导黄曲霉孢子细胞凋亡。通过分子模拟，我们推测麝香草酚可能与膜上钾离子通道KCNAB互作，导致线粒体损伤，引起细胞凋亡。在本项目中我们拟通过膜片钳技术检测细胞内钾离子电位变化，研究麝香草酚对KCNAB的影响；通过点突变技术研究KCNAB与麝香草酚的互作位点；通过western blot技术研究细胞色素c、Aif等凋亡因子释放；通过基因敲除技术研究KCNAB、Aif、caspase 9、caspase 3等因子在黄曲霉孢子细胞凋亡中的作用，并构建其凋亡途径。了解麝香草酚诱导黄曲霉孢子凋亡的分子机制，可以为麝香草酚控制黄曲霉污染应用提供理论基础；为针对黄曲霉或其它真菌病病原物的新药开发提供靶标；为抗病育种研究提供新思路。

本研究揭示了麝香草酚靶向电压门控K+通道诱导黄曲霉孢子细胞凋亡的分子机制。前期预测该通道β亚基KCNAB可与麝香草酚互作。体外实验证实麝香草酚可以激活KCNAB醛酮还原酶活性。但是KCNAB缺失突变体对麝香草酚反应更敏感，可能由于β亚基在电压门控活性中只起调控作用。而α亚基负责K+激发，但在黄曲霉基因组内尚未注释。通过靶向K+选择器的生物信息学筛选，预测到两个潜在的α亚基：kv-1和kv-2。通过绿色荧光蛋白标记及激光共聚焦显微观察发现这两个蛋白都定位在细胞膜上。体外合成这两个蛋白的cRNA，并注射到非洲爪蟾的蛙卵细胞进行表达。通过电压钳发现kv-1/ kv-2与KCNAB共表达体系电压门控活性显著，而且都能被麝香草酚激活。分别敲除kv-1和kv-2的基因，发现kv-1基因缺失突变体对麝香草酚敏感性没有显著变化，但孢子死亡情况轻度缓解；而kv-2基因缺失可以显著增强对麝香草酚抗性，孢子凋亡情况被显著抑制。这说明麝香草酚可同时激活kv-1和kv-2，但是kv-2主要负责孢子凋亡。通过各种荧光探针标记，采用流式细胞术和荧光显微技术发现麝香草酚处理导致黄曲霉孢子发生了原生质体浓缩，膜上磷脂酰丝氨酸外翻，线粒体膜电位减弱，细胞色素c释放，Caspase激活，DNA片段化等经典凋亡事件。尽管真菌中尚未发现Caspase，但使用Caspase 9专一性底物能够检测到麝香草酚诱导的Caspase 9活性提高，而且Caspase抑制剂Z-VAD-FMK可以缓解孢子凋亡发生。这表明黄曲霉中存在与哺乳动物同源性差异较大的caspase来介导凋亡的发生。研究结果为麝香草酚在食品、饲料、环境领域控制黄曲霉污染中的应用提供了理论支持。此外研究发现了KCNAB在黄曲霉孢子萌发、侵染、产毒中的关键作用，可以作为药物设计或者农作物抗黄曲霉育种的靶标。研究还发现了外源Fe2+可诱导黄曲霉孢子铁死亡的现象，支持补铁剂可以应用在食品防霉领域。研究中还建立了一种粮库玉米黄曲霉污染预警与控制系统，以及可以与移动终端偶联适用于消费者的黄曲霉毒素检测方法。本项目的研究成果从多个角度为黄曲霉污染危机的解决提供理论与技术支持。