水稻淀粉多酶复合物的互作模式变化及其磷酸化修饰调控机制

Rice (Oryza sativa L.) is one of the most important cereal crops in worldwide. but rice grain quality is low in China, and usually means of rice or rice products can’t meet the demand of end-users. Starch synthesis is the most important influence factor of rice grain quality. Starch biosynthesis is a complex network of many enzymes by the formation of starch multi-enzymes complexes. The formation of starch multi-enzymes complexes was significantly different among indica, japonica and waxy rice. It is necessary to clarify the changes of interaction patters of multi-enzymes complexes in different rice varieties, and reveal the regulation mechanism of multi-enzymes complexes.. Based on our previous researches, different rice varieties including indica, japonica and waxy are used as test materials. Gel permeation chromatography (GPC), co-immunoprecipitation (Co-IP) and bimolecular fluorescence complementation (BiFC) are carried out to discover the changes of interaction patters of multi-enzymes complexes in different rice varieties. Phosphorylated modification of starch synthesis related enzymes will be obtained by high throughput sequencing. Crispr/cas9 system is performed to obtain the phosphorylated modification mutants, and then the changes of starch multi-enzymes complexes will be analyzed to illustrate the phosphorylated modification of starch enzyme complex regulation mechanism. Our researches of this project would provide helpful information to cultivate high quality rice varieties and improve agricultural competitiveness in china.

水稻是重要的粮食作物，中国稻米品质表现总体偏低，在一定程度上影响了其市场竞争力。淀粉合成是决定稻米品质的最主要因素，其合成由一系列酶通过相互作用形成多酶复合物介导完成。籼稻、粳稻及糯稻多酶复合物的形成具有较大差异，揭示不同水稻品种淀粉多酶复合物的互作模式变化及其调控机制，对稻米品质的改良具有重要的意义。.本项目在前期研究基础上，以常规籼稻、粳稻及糯稻为试材，利用凝胶渗透色谱（GPC）、Co-IP及BiFC方法研究不同水稻品种淀粉多酶复合物的互作模式变化，揭示多酶复合物的形成规律；通过高通量测序技术，获得具有磷酸化修饰的淀粉合成相关酶；应用Crispr/cas9定点突变技术，对具有磷酸化修饰的酶进行编辑，获得突变体植株，分析野生型和突变体淀粉多酶复合物的形成变化，阐明磷酸化修饰对淀粉多酶复合物的调控机理。本项目研究可为不同类型水稻品质的改良提供理论基础，对提高我国农业竞争力具有重要的意义。

淀粉合成是决定稻米品质的最主要因素，其合成由一系列酶通过相互作用形成多酶复合物介导完成。前期研究发现籼稻、粳稻及糯稻的淀粉合成相关酶表达谱差异较大。本项目利用qRT-PCR、western blot、凝胶渗透色谱（GPC）及Co-IP等方法对籼稻、粳稻及糯稻进行淀粉合成相关酶及多酶复合体分析，发现在糯稻中淀粉合成相关酶的表达量都上升，SSI-SSIIa在糯稻中互作较弱，SSI-PUL在糯稻中不具有互作，SSs和BEs在籼稻和粳稻中的互作差异较大，揭示了不同水稻品种中淀粉多酶复合体的互作模式不同。利用高通量测序技术对籼稻（广陆矮和9311）和粳稻（日本晴）的胚乳总蛋白进行磷酸化修饰测定，分别鉴定获得了2079、2434和3290个具有磷酸化修饰的蛋白质，覆盖了2441、2808和6742个磷酸化位点；其中淀粉合成相关酶AGPase、 SSIIa、SSIIIa、 BEI、BEIIb、 PUL 和waxy具有磷酸化修饰位点差异。针对具有磷酸化修饰差异的BEIIb和PUL，应用Crispr/cas9定点突变技术对日本晴愈伤组织进行基因编辑，获得be2b和pul突变体植株。分析be2b和pul突变体植株生理生化特性发现，pul突变体表型变化不明显；be2b突变体千粒重及淀粉含量降低、而抗性淀粉、长链脂肪酸和蛋白质含量升高。利用Co-IP、HPLC-MS、代谢组学和蛋白组学方法进一步对野生型和be2b突变体进行分析，发现SSs和BEs形成的多酶复合体差异较大，此外be2b突变体中涉及糖酵解、TCA循环以及乙酰辅酶A合成通路的代谢物及蛋白质具有差异表达，研究结果揭示了淀粉合成的变化会导致胚乳碳分配的变化，引起储能物质的改变。本项目研究可为水稻品质的改良提供理论基础，对提高我国农业竞争力具有重要的意义。