基于T7/T7RNAP调控的GGPS、PSY和CrtI质体转基因在番茄果实中过量共表达对番茄红素合成的影响

高番茄红素含量是番茄育种的重要目标，但常规育种和细胞核转基因技术在提高番茄红素含量上都存在局限。本项目拟将番茄的牻牛儿基牻牛儿基焦磷酸合成酶基因GGPS2和八氢番茄红素合成酶基因PSY1、以及欧文氏菌的八氢番茄红素脱氢酶基因CrtI构成由T7启动子和T7terⅡ终结子控制的操纵子，定点整合进番茄质体基因组，再由PDS启动子控制的ptT7RNAP基因，在果实成熟过程中表达定位于质体的T7 RNA 聚合酶，专一性诱导T7::GGPS2-PSY1-CrtI质体转基因在果实中过量共表达，构成一条高效的番茄红素合成途径，并与细胞核内同期表达的一组基因一起，共同促进番茄红素合成。该研究将深入探讨相关核/质基因的表达水平、协作机制、及对番茄红素合成的影响，建立由T7/T7RNAP原核转录机制控制的质体转基因在番茄果实组织中的高效表达系统，获得高番茄红素的优异新材料，为番茄品质育种等研究奠定基础。

番茄红素是番茄品质的重要指标，但常规育种和核转基因改良在显著提高番茄红素含量上存在难度。如果在番茄果实的质体中建立一条独立的番茄红素合成途径，则有可能大幅度促进番茄红素积累。本项目从LeGGPS2、LePSY1和CtrI基因共表达的番茄质体转化载体构建与原核表达验证，将T7::GGPS2-PSY1-CtrI目的基因整合进番茄质体基因组，分析T7::GGPS2-PSY1-CtrI质体转基因的功能等3个方面开展了研究。结果显示，（1）从英国番茄Ailsa Craig成熟果实中克隆的LeGGPS2和LePSY1基因的cDNA序列，是新的等位基因；与欧文氏菌的八氢番茄红素脱氢酶基因CrtI一起，分别添加上核糖体结合位点后，由T7启动子和T7terII 终止子控制并构成操纵子结构，重组进pET32a(+)原核表达载体，转化进大肠杆菌菌株BL21 (DE3)后在含3％蔗糖的LB培养基 (pH 6.8) 中，于37℃摇8 h左右的对数生长后期加IPTG至80 μmol/L，30℃诱导表达5 h的发酵条件下，获得2.124 mg/g DCW的番茄红素，表明原核化的3个目的基因具有预期的功能，且构成了合成番茄红素的独立途径。（2）克隆了番茄质体trnI-trnA基因，并作为与番茄质体基因组整合时的同源重组片段，构建了T7::GGPS2-PSY1-CtrI基因的番茄质体转化载体；经原核验证，该载体上位于两个同向LoxP位点间的Prrn::mGFP-aadA选择标记基因能够被Cre重组酶有效删除。（3）构建了基于Cre/LoxP重组系统进行质体/核选择标记基因删除的和用于以T7RNAP诱导质体T7::GGPS2-PSY1-CtrI转基因表达的双元表达载体，并证实了对核选择标记基因删除的有效性。（4）建立微弹介导途径转化番茄质体的方法，将T7::GGPS2-PSY1-CtrI基因和Prrn::mGFP-aadA选择标记基因整合进了番茄基因组，但质体转基因未能得到同质化，果实之间的番茄红素含量差异较大。该研究为今后深入开展番茄质体转化以及通过质体转基因进行番茄性状改良等工作奠定了基础。