兔出血症病毒非结构蛋白NSP6抑制IFN-β产生的分子机制

Non-structural proteins 6(NSP6) of rabbit hemorrhagic disease virus (RHDV) belongs to 3C-like protease. This kind of protease is closely related to virus replication and pathogenicity. Our previous studies showed antiviral molecules of innate immunity in liver decreased significantly after RHDV infection and NSP6 had strongest inhibitory effects on IFN-β promoter activation. That suggested NSP6 can inhibit the IFN-β production, but the underlying mechanisms remain unclear. In this research, we first study the NF-κB and IRF3 signal pathways influenced by NSP6, using the luciferase reporter. Then, after overexpression of IPS-1 and NEMO, we will research the effects on inhibition of IFN-β production mediated by NSP6, and confirm the key signal molecules. At last, we will study the relationship between the catalytic activity and the ability of inhibiting IFN-β production of NSP6 by using NSP6 mutants. Collectively, the study can clarify the mechanism of non-structural proteins 6 of RHDV inhibiting IFN-β production, and enrich the mechanisms of pathogenesis in RHDV.

兔出血症病毒（RHDV）的非结构蛋白NSP6属于3C样蛋白酶，该类蛋白酶与病毒的复制和致病性密切相关。我们前期发现，RHDV感染后肝脏组织内干扰素诱导蛋白显著下调，且NSP6可极显著抑制干扰素β（IFN-β）启动子活性，提示NSP6在抑制IFN-β产生中发挥重要作用，然而具体机制未知。本项目拟通过真核表达NSP6蛋白，检测NF-κB/p65和IRF3的激活情况，明确NSP6对NF-κB和IRF3信号通路的影响；在此基础上，过表达I型干扰素产生途径中IPS-1和NEMO等重要信号分子，检测NSP6对信号分子诱导IFN-β产生的影响，明确与NSP6抑制IFN-β产生相关的关键信号分子。最后通过构建突变体NSP6，分析NSP6抑制IFN-β产生与其蛋白酶活性的依赖关系。本项目的开展将系统阐明NSP6蛋白抑制IFN-β产生的分子机制，丰富RHDV的致病机理。

兔出血症病毒（RHDV）感染引起的兔出血症（RHD）是一种毁灭性疫病，严重危害全球养兔业。RHDV非结构蛋白NSP6是一种丝氨酸蛋白酶，与病毒的致病性密切相关。既往研究表明，RHDV能抑制IFN-β产生并且能够诱导RK13细胞凋亡，然而具体机制尚不清楚。本实验以兔天然免疫信号通路为切入点，构建了兔IFN-β启动子及其顺式作用元件IRF-3和NF-κB结合位点荧光素酶报告基因检测系统，并利用该系统对分析NSP6抑制IFN-β产生的作用机制。另外还揭示了NSP6诱导细胞凋亡的作用机制，具体内容如下：.1、兔出血症病毒NSP6蛋白抑制IFN-β产生的分子机制.以兔天然免疫信号通路为切入点，构建了兔IFN-β启动子及其顺式作用元件IRF-3和NF-κB结合位点荧光素酶报告基因检测系统，并利用该系统对NSP6蛋白激活IFN-β启动子和重要的转录因子结合元件（IRF3和NF-κB）的效率进行比较，分析NSP6对IFN-β、IRF3和NF-κB活性的影响，另外对NSP6酶活性中心进行点突变，分析NSP6突变体抑制IFN-β启动子活性的情况，探究NSP6抑制I型干扰素产生与其蛋白酶活性的依赖关系。结果表明NSP6能够显著抑制IRF3和NF-κB活性，并抑制兔IFN-β基因启动子的相对荧光素酶活性，单突变NSP6酶活性位点氨基酸使NSP6抑制IFN-β产生的作用显著减弱，这些结果暗示NSP6可能通过对NF-κB和IRF3信号通路的影响来抑制IFN-β产生，并且NSP6蛋白酶活性与其抑制I型干扰素产生相关。.2、 兔出血症病毒NSP6蛋白诱导细胞凋亡的机制.分别在不同细胞中过表达病毒NSP6蛋白，通过荧光显微镜观察明确了NSP6在细胞中的表达和定位；利用流式细胞术和tunel检测确定了NSP6能够促进细胞凋亡；在宿主细胞RK13中过表达NSP6，发现caspase-3、-8和-9的活性显著增高；对NSP6酶活性中心进行点突变，发现NSP6诱导细胞凋亡的能力被酶活性中心His27残基的突变严重削弱；最后将BCL2L1序列通过同源重组克隆入慢病毒表达载体pLVX-mCherry，筛选出过表达BCL2L1的细胞，发现过表达BCL2L1能够显著抑制NSP6诱导的caspase3和caspase 9酶的活性，并降低RK13细胞的凋亡率，暗示BCL2L1可以抵抗NSP6诱导的细胞凋亡作用。