亚抑菌浓度亚胺培南促进MRSA膜囊泡分泌的分子机制及后效应研究

Objectives：To explore the molecular mechanism of sub-inhibitory concentration of imipenem in facilitating MRSA membrane vesicles release and the effects of the released MVs facilited by sub-inhibitory concentration of imipenem(CI-MVs).Methods:Cell invasion assay and human apoptosis protein array were used to determine the pathogenicity and its potential mechanism, and spectrophotometry,MIC method were employed to detect the effects of CI-MVs on the proliferation and antibiotics resistance features of carbapenem resistant gram negative bacteria.Moreover,RNA sequencing technique was used to screen the key regulatory gene of sub-inhibitory concentration of imipenem on MRSA MVs release,and gene knockout technique was used to verify the functions of this gene.Expected results:Through special pathway,CI-MVs can facilitate apoptosis of host cells,strengthen in vitro invasion abilities of MRSA strains and influence the proliferation and antibiotics resistance features of CR-GNBs.Furthermore,sub-inhibitory concentration of imipenem can regulate MRSA CVs release through a key regulatory gene.The specific regulating mechanism is still needed to be investigated,related reports were rare.

目的：探究亚抑菌浓度亚胺培南对MRSA膜囊泡（MVs）分泌的分子机制及其促进MRSA分泌的MVs（CI-MVs）的具体功能；方法：采用细胞侵袭实验和蛋白芯片技术分别检测CI-MVs的致病性及其可能作用机制，采用分光光度法、MIC法检测CI-MVs对碳青霉烯类抗生素耐药革兰氏阴性菌（CR-GNB）临床分离株增殖及耐药性的影响，并采用RNA测序技术探究其影响机制；进一步采用RNA测序技术筛选亚抑菌浓度亚胺培南通过哪个调控基因实现其对MVs分泌的影响，并采用基因敲除技术验证该基因的功能。预期研究成果:CI-MVs可通过特定途径促进宿主细胞凋亡、增强MRSA体外细胞侵袭能力、对CR-GNB增殖及耐药性产生影响；亚抑菌浓度亚胺培南通过某个关键调控基因实现其对MRSA MVs释放的影响。具体机制有待进一步探究，目前相关报道甚少。

碳青霉烯类抗生素作为β-内酰胺类抗生素的一个重要分支，是目前用于治疗多重耐药革兰阴性菌感染时的少数几种抗生素之一，其可从多个角度影响金黄色葡萄球菌的生物学活性，包括促进金葡菌ɑ-溶血素释放、诱导万古霉素耐药株出现等。但碳青霉烯类抗生素对MRSA外泌体分泌及功能影响的报道甚少。而金黄色葡萄球菌外泌体被证实包含多种生物活性蛋白及DNA或RNA成分，可介导金黄色葡萄球菌致病性及宿主免疫细胞应答等多种功能。本研究尝试对亚抑菌浓度亚胺培南调控MRSA外泌体的效应及机制进行研究。结果发现亚抑菌浓度亚胺培南可显著促进MRSA外泌体分泌，并显著影响外泌体蛋白成分组成，影响效应与亚胺培南浓度呈正相关。蛋白质组学实验结果显示，亚抑菌浓度亚胺培南可对MRSA多种代谢调控通路相关蛋白表达产生影响，但研究预期的sigma S调控基因mRNA表达水平未发生显著改变。CI-MVs可对碳青霉烯耐药肺炎克雷伯菌（CRE）和鲍曼不动杆菌（CRAB）多种代谢及基因调控系统相关基因mRNA表达水平产生影响，但对CRE和CRAB体外增殖及耐药性无影响。CI-MVs促进A549细胞凋亡可能主要与激活BCL-2蛋白家族有关。vraS/vraR二元调控系统关键蛋白在亚抑菌浓度亚胺培南作用下表达水平明显上调，可能是MRSA对亚抑菌浓度亚胺培南压力应答的一个关键机制，但是否与外泌体分泌调控相关有待进一步验证。CI-MVs对宿主细胞及其他微生物的潜在生物学功能有待进一步挖掘和验证。