质膜水通道蛋白CcPIP在山核桃嫁接成活过程中的作用及机制研究

Plant aquaporins play a very important role in the water movement across the membrane. Plenty of available water is the key to grafting. A plasma membrane intrinsic protein CcPIP in hickory (Carya cathayensis) during graft process was cloned using cDNA-AFLP. We found that CcPIP play a role of gene expression and regulation in water movement during graft process, and also observed that ABA and salt stress can inhibit gene expression. In this project, we will use the molecular biology and immuno-gold technique to observe the effect of CcPIP on grafting, illustrate the role of this gene on the combined effect of rootstock-scion and clarify its relationship with the formation of vascular bridge from three levels of whole - tissue - cells. It will not noly enlarge the information of the aquaporin gene family and provide a basis for aquaporin research, but also benefit to uncover the mechanism of water movement across the membrane and the function of CcPIP in hickory during graft process, and provide a theoretical basis for horticulture cultivation of hickory and other woody plants.

在水分的跨膜运输过程中，植物水通道蛋白起到非常重要的作用。有充足的可利用的有效水是嫁接成活的关键。本课题组利用cDNA-AFLP技术在山核桃嫁接成活过程中克隆到一个质膜水通道蛋白CcPIP，在前期研究中，我们发现该基因在山核桃嫁接成活的水分运输过程中起到表达调控的作用，并在预实验中观察到ABA和盐胁迫处理抑制水通道蛋白表达。本项目拟采用分子生物学、免疫胶体金定位技术等方法，从整体－组织－细胞三个层次，观察山核桃质膜水通道蛋白CcPIP表达特性对山核桃嫁接成活过程的影响，来阐明这一基因在砧穗联合效应中的作用及其与维管束桥形成的相互关系，不仅丰富了水通道蛋白基因家族的基因信息，为水通道蛋白的研究提供了良好的物质基础，而且有助于揭示CcPIP影响山核桃嫁接成活的作用机制和山核桃嫁接过程水分跨膜运输机制，为山核桃等木本植物园艺化栽培提供一定的理论基础。

山核桃(Carya cathayensis Sarg.)是我国特有的名优干果和木本油料植物。嫁接是解决山核桃园艺化、良种化栽培的重要手段。水是植物细胞的重要组成成分，植物水通道蛋白是细胞间和细胞内水分快速运输的主要通道。通过克隆山核桃CcPIP启动子序列，利用定量RT-PCR、非洲爪蟾卵母细胞异源表达、生理功能检测、转基因技术等方法对山核桃水通道蛋白进行表达特性和功能的研究，发现CcPIP启动子序列具有真核生物启动子序列的一般特征。长度为768bp（-50--818）的CcPIP启动子片段具有很强的表达调控功能。山核桃CcPIP是一个水通道蛋白，它具有水分子快速运输的功能。CcPIP主要定位在细胞质膜上，这与其它植物质膜水通道蛋白PIP的功能相一致。在盐胁迫、干旱胁迫条件下，转山核桃CcPIP基因拟南芥生长更好，但过氧化氢和甘露醇处理变化不大。.NaCl处理的山核桃CcPIP基因的表达量明显降低，而ABA处理的山核桃CcPIP基因的表达量明显升高。通过DTT处理，CcPIP基因的表达量在接穗和砧木中的表达模式都是先下降后上升。通过甘露醇处理可以看出，CcPIP基因的表达量无论是在砧木还是接穗中都没有一定的规律。在ABA处理中，接穗和砧木的相对电导率下降。在DTT处理中，接穗和砧木的相对电导率在嫁接后14d时间里相对电导率逐渐下降。.通过sRNA测序分析，获得属于15个miRNA基因家族的10个新miRNA和8个潜在的新miRNA。预测了保守miRNA基因的89个靶基因和新的miRNA基因的26个靶基因。通过转录组测序分析，鉴别出大量调控逆境胁迫与抗病、淀粉代谢、萜类代谢、细胞信号转导等，在山核桃嫁接过程中起着直接或间接的作用。同时，15个水通道蛋白PIP被鉴定，为山核桃后续功能基因组研究奠定了坚实基础。.针对这些PIP基因和相应的小RNA，拟进一步挖掘山核桃嫁接过程中小分子RNA、转录组和表达谱变化数据，以期获得与CcPIP互作的功能蛋白，进行功能解析，进一步阐明PIP在山核桃嫁接成活过程中的生物学功能。