以gp41为靶点的小分子艾滋病融合抑制剂的作用机制和筛选的方法学研究

申请项目将建立以HIV gp41 N-端七联重复序列（NHR）为靶点的小分子艾滋病融合抑制剂筛选，作用机理和构效关系研究方法。小分子有望取代目前唯一的肽类融合抑制剂T20成为廉价的可口服使用的新型抗艾滋病药物。迄今为止,小分子设计均针对晶体结构预测的NHR口袋；虽不断有新化合物报导，但机理确定和活性改进停滞不前。由于NHR的作用方式为蛋白-蛋白相互作用，涉及大的结合面和不同的结合位点，我们认为应系统研究小分子与NHR不同位点的作用以明确机理，以此为基础建立筛选和活性评价方法。我们将借鉴我们建立的金属络合物多肽技术设计针对不同结合位点，结合强度可调，涵盖全部NHR序列的靶点和探针，建立荧光定量测定方法；综合多种手段定量研究小分子与NHR的作用全貌，确定可能的小分子结合位点，建立高通量筛选方法以发现与不同位点专一结合的小分子片段。为针对gp41的高活性艾滋病融合抑制剂设计和开发提供新的思路。

课题目的是研究HIV-1包膜糖蛋跨膜亚基 gp41 N-端七联重复区（NHR）与C-端七联重复区（CHR）的相互作用，发现新的小分子融合抑制剂靶点。为达此目的，我们设计涵盖HIV-1 gp41全部胞外区的NHR-多肽（N-肽）和CHR-多肽（C-肽），研究gp41 NHR-CHR相互作用。我们发现源自HIV-1 gp41氨基酸序列614-677间所有以七联重复序列a、d位残基起始的36肽都显示出很高的HIV-1融合抑制活性。针对目前普遍认为的C-肽融合抑制剂必须通关键结合区与NHR中靶点作用才能发挥高活性，例如已报道的高活性C-肽融合抑制剂T20、C34及CP32 ，我们的发现是一个重要突破，预示着从基本coiled-coil蛋白相互作用出发能更好地了解gp41 NHR-CHR相互作用，为融合抑制剂设计拓宽方向。因此，我们以C-肽为探针，从coiled-coil相互作用的本质出发研究HIV-1融合抑制剂的作用机理。我们发现HIV-1 gp41 NHR-CHR相互作用遵循普遍的coiled-coil作用规律，以前发现的关键结合区对融合抑制剂发挥高活性并不是必须的。我们以HIV-1 gp41 NHR-CHR六螺旋束为模型，系统研究了coiled-coil相互作用，发现具有相似理化性质的氨基酸残基可大体相互替换而不破坏coiled-coil相互作用。我们还进一步发现可在普遍认为不可取代的gp41中高度保守的结合位点上引入突变，设计出具有更高活性的融合抑制剂。在这些认识基础上，我们成功设计了多种具有不同作用机制的新型高活性HIV融合抑制剂，包括和已知蛋白完全无序列同源性的人工设计多肽、不含关键结合区的短肽系列、源自其它病毒相关蛋白序列的多肽、以及多种多肽缀合物和类肽融合抑制剂。我们还对不同类型C-肽融合抑制剂组合使用引起的超强协同效应机制进行了研究。发现C-肽间不寻常的弱相互作用是导致超强协同效应的根本原因。我们的工作加深了对HIV-1 gp41分子内相互作用的了解，有利于进一步明确病毒-细胞膜融合、病毒感染及融合抑制剂的作用机制，为融合抑制剂的设计拓宽了方向。该基金资助下已发表12篇文章，其中影响因子>5的文章6篇；申请6项PCT专利，5项已公开；超额完成预期目标。