BMP15与GDF9基因在水牛卵泡发生中的作用机制研究

BMP15和GDF-9在决定动物卵泡发生、排卵数和窝产仔数中发挥着至关重要的作用。本研究拟克隆水牛BMP15和GDF9等基因，通过QRT-PCR、原位杂交和免疫组化等手段，探索其在水牛卵泡发生不同阶段的表达模式及在细胞中的定位，并通过检测不同时期样本BMP15和GDF9基因启动区甲基化水平，建立起BMP15、GDF9转录水平与启动区甲基化水平的关联，阐明其表达调控的可能机制。构建荧光蛋白融合表达载体，应用荧光能量共振转移技术研究BMP15、GDF9 和ALK3(5、6)受体的相互作用模式，找到其活性蛋白方式，并完善细胞通路和作用网络研究。应用穿膜肽融合表达纯化水牛BMP15和GDF9成熟肽蛋白质，在水牛卵泡培养液中添加不同浓度和组合的蛋白，观测其对不同时期卵泡体外培养的影响，优化现有培养系统。通过锌指酶技术定点突变水牛BMP15，充分开发利用其原始卵泡库，挖掘优良母水牛生殖潜能。

克隆水牛BMP15基因CDS和全基因组序列，长度分别为1185 bp和6490 bp，与奶牛序列相似性98%和97%。水牛GDF9全长CDS为1362bp，与奶牛序列相似性98%，预测水牛BMP15和GDF9蛋白分别在290-368AA和389-449AA位点间存在保守TGFβ功能域。胎儿期到优势化卵泡发生阶段等各时期BMP15、Kit和C-kit均表达，但胎儿期卵巢BMP15最低。克隆BMP15启动子序列构建BMP15启动子荧光报告载体，分别转水牛BFF、颗粒细胞和注射卵母细胞，发现BMP15在卵母细胞高效启动标记荧光蛋白EGFP表达；为解析BMP15、GDF9受体，通过BiFC技术，经细胞转染，发现BMP15受体有Alk3、Alk5、Alk6，且与Alk6亲合力高，BMP15既能形成同源二聚体又能与GDF9形成异源二聚体；GDF9受体有Alk6；定性分析BMP15与Alk6及FecB突变类型Alk6亲和力发现，BMP15与FecB突变类型Alk6亲和力较野生型下降。成功创建水牛源FecB突变转基因小鼠，并扩繁获得后代；构建TALEN载体及报告载体RGS、pSSA-LUC，细胞水平表明水牛BMP15的 TALEN位点1效率40%，FOXO3的TALEN位点1效率31.3%。mRNA胞质注射水牛、小鼠胚胎，BMP15 TALEN位点1无突变，FOXO3 TALEN1在48胚胎中4个突变。FOXO3敲除小鼠模型中20只小鼠7只突变；分别构建gRNA序列和相应gRNA活性检测报告载体，联合Cas9共转293T，检测gRNA介导Cas9靶向切割BMP15和GDF9候选位点活性发现，b-BMP15-gRNA2/4/5和b-GDF9-gRNA4/5具较高效率；以水牛BFF细胞为供体筛选水牛BMP15和GDF9靶向突变细胞系。对单基因敲除发现，b-BMP15-gRNA4/5靶向敲除效率分别44.4%和55.6%，b-GDF9-gRNA4/5靶向敲除效率分别30.8%和40%。当对水牛BMP15和GDF9双基因敲除时，载体b-BMP15-gRNA4/b-GDF9-gRNA5的BMP15敲除效率37.5%，GDF9为10%； b-BMP15-gRNA5/ b-GDF9-gRNA4载体的BMP15敲除效率为30%，GDF9为40%，证明在水牛BFF细胞上可同时对两个目标基因进行编辑。