杏果实香气物质形成特异CCD基因家族成员的克隆及功能解析

Apricot has unique aroma smell and is one of the main stone fruit trees. Some apocarotenoids with aroma smell are characteristic compounds of apricot, which contribute to its "flower-odor". The key genes which regulate the trait and their mechanism of regulation have not yet identified. Our pilot study found that the accumulation of apocarotenoids in apricot of different colors is directly related with the formation of apocarotenoids of apricot fruits. Base on this observation, we predicted that carotenoid cleavage dioxygenases (CCDs ) has played an important role in the process. In this study, using apricot fruits with different colors as experimental materials, we planned to identify apocarotenoids aroma components in apricots fruit, clone their PaCCDs genes family members, analyze the changes of apocarotenoids and the PaCCDs genes expression pattern in different stages during fruit development, and identify the specific PaCCDs genes which may be involved in the apricots aroma components formation. The genes functions will be studied by methods including substrate specificities identification, subcellular localization, RNAi and excessive expression in tomato. The aim of this study is to elucidate the molecular mechanism in which CCDs family members regulate the formation of fragrance and colors of apricot. The results obtained not only can deepen our understanding of fruit aroma quality formation, but also will provide some theoretical and practical information in apricot fruit aroma quality regulation and breeding.

杏是重要的核果类果树，其果实香味独特。一些具有芳香味的脱辅基类胡萝卜素是杏果实重要的“花香型”特征香气物质，但有关调控机理及其关键基因迄今并不清楚。我们前期发现，不同色泽杏果实脱辅基类胡萝卜素香气物质的形成与类胡萝卜素的积累有明显的相关性，据此，我们推测CCD可能在这一过程中扮有重要作用。本项目拟在前期基础上，以不同色泽的杏果实为材料，分析鉴定各品种成熟果实脱辅基类胡萝卜素香气成分，克隆PaCCDs基因家族成员，研究果实不同发育阶段的脱辅基类胡萝卜素的变化规律及PaCCDs的表达模式，确定可能参与杏果实香气形成特异的PaCCDs基因家族成员；重点通过底物特异性测定，亚细胞定位、RNAi及超量表达转化番茄进行基因功能研究，系统阐明特异CCDs调控杏果实香气物质形成和色泽的分子机制。研究结果不仅可以加深我们对果实香气品质形成的认识，还将为杏果实香气品质调控和育种提供理论和实践依据。

芳香味脱辅基类胡萝卜素是杏果实重要的“花香味”特征香气成分。但控制这类化合物合成的关键基因还未得到分离鉴定，其代谢形成的具体机制也不清楚。为解析这一生物学过程，首先对比分析了不同色泽杏品种果实中类胡萝卜素的积累情况，结果发现浅色品种中类胡萝卜素的含量远低于深色品种，而芳香味脱辅基类胡萝卜素的含量显著高于深色品种。进一步的基因表达分析发现，果实成熟过程中，负责类胡萝卜素合成的9个结构基因在浅色品种‘轮台小白杏’和深色品种‘佳娜丽’果实中的表达都迅速增加，但在两个品种间无显著差异，而负责类胡萝卜素裂解的基因CCD1在 ‘轮台小白杏’果实中的表达受成熟迅速诱导，其在‘佳娜丽’中的表达保持在很低水平，同时，CCD1在果实中特异高表达。因此，推测CCD1可能裂解果实中的类胡萝卜素形成特定香气成分，同时导致果实色泽变浅。为验证这一假说，使用RACE得到了PaCCD1 cDNA全长。系统分析发现，PaCCD1 与 AtCCD1 及其它果实的CCD1聚在同一分支上。氨基酸序列比对发现，PaCCD1与其它已知功能的CCD1相同，具有4个保守的组氨酸残基、2个半保守的谷氨酸残基和1个天冬氨酸残基。该基因定位于细胞质和叶绿体。功能研究发现，CCD酶活性抑制剂Abamine-SG处理能显著促进‘轮台小白杏’中β-胡萝卜素和叶黄质的积累，而显著阻碍芳香味脱辅基类胡萝卜素的合成及PaCCD1的转录。‘佳娜丽’果实中瞬时过表达PaCCD1显著加速了果实中β-胡萝卜素和叶黄质裂解为芳香味脱辅基类胡萝卜素，证明PaCCD1具有裂解类胡萝卜素形成特定香气成分的生物学功能。为了深入了解PaCCD1调控芳香味脱辅基类胡萝卜素形成的多样性机制，体外蛋白饲喂试验发现，PaCCD1蛋白能较快吸收β-胡萝卜素产生二氢-β-紫罗兰酮和β-紫罗兰酮，也能吸收叶黄质产生β-大马酮。表明该蛋白能通过特异裂解这两种类胡萝卜素产生相应的香气成分。综合上述结果，我们解析了PaCCD1特异裂解类胡萝卜素形成杏果实香气成分的生物学功能及机制，研究结果为通过栽培和育种途径调控杏果实香气品质提供了理论依据。在本项目的资助下，已在园艺学报、中国农业科学、Int J Mol Sci、J Am Soc Hortic Sc、BMC Genomics等期刊上共发表相关论文7篇；培养研究生5名，本科生2名；项目组成员参加国内外会议交流9人次。