深黄被孢霉高产共轭亚油酸工程菌株的构建及其代谢规律的研究

Conjugated linoleic acid (CLA) refers to a mixture of positional and geometric isomers of linoleic acid with conjugated double bonds.CLA are well known for numerous beneficial effects as functional foods,such as anti-carcinogenic and anti-atherosclerosis activity, and modulatory effects on the immune system and lipid metabolism. Traditional organic synthesis is highly capital-intensive and result in an isomeric mixture of CLA isomers. Linoleic acid isomerase are enzymes responsible for conversion of linoleic acid (LA) to CLA.This project focuses on the biotechnological production of CLA, through construction of transgenic oleaginous molds (Mortierella isabellina) which originally have high LA content to accumulate large quantity of CLA. Propionibacterium acnes linoleic acid isomerase gene that can convert linoleic acid to t10,c12-CLA was introduced and expressed under the control of fungi-specific gpd/gla promoter.We will analyze the fatty acid composition of the transgenic strain by gas chromatography and characterize the biochemical properties of the enzyme in detail to fully understand the mechanism during the biosynthesis of conjugated linoleic acid in Mortierella isabellina.Our work will construct a transgenic M.isabellina producing t10,c12-CLA,which could have important industrial value.

共轭亚油酸(Conjugated linoleic acid, CLA)是一种新型的食品功能性油脂，具有抗癌、降脂、调理免疫、抗动脉粥样硬化等重要的生理功能。亚油酸异构酶能催化亚油酸(LA)合成CLA。申请人发现采用基因异源表达技术将疮疱丙酸杆菌来源的亚油酸异构酶基因PAI导入高产LA的深黄被孢霉后，深黄被孢霉工程菌株能利用自身产生的LA作为前体合成CLA单一异构体。本项目拟运用实时荧光定量PCR、Western杂交以及体外酶活测定技术,分析高产CLA深黄被孢霉工程菌株中异源亚油酸异构酶基因在真菌特异的强启动子Pgpd/gla控制下的转录水平及蛋白表达量，明确亚油酸异构酶的酶学性质及催化机制；通过高效气相色谱检测发酵过程中LA、CLA及其它主要脂肪酸含量的动态变化,揭示深黄被孢霉工程菌株中CLA的代谢规律。此项研究成果可一步法生物合成CLA,为实现微生物转化法规模化生产CLA奠定基础。

共轭亚油酸（Conjugated linoleic acid, CLA）是一类含有共轭双键的十八碳二烯酸，是由人体必需脂肪酸亚油酸（Linoleic acid, LA）衍生而成的一系列位置和几何异构体的总称，具有抗癌、降脂、增强免疫、抗动脉粥样硬化等重要的生理功能，其中t10,c12-CLA是最具生理活性的异构体之一。天然CLA主要存在于奶制品、肉制品和瘤胃动物来源的食品中，但含量很少。目前工业上主要利用化学异构法生产共轭亚油酸，但是产物是多种异构体的混合物，分离纯化困难，且成本高、价格昂贵。来源于痤疮丙酸杆菌（Propionibacterium acnes）的亚油酸异构酶（PAI）是一种胞内可溶蛋白，能够将亚油酸（LA）特异性地转化成单一的具有生理活性的共轭亚油酸 t10,c12-CLA。本项目采用基因异源表达技术将疮疱丙酸杆菌来源的亚油酸异构酶基因PAI导入高产LA的被孢霉，使其在强启动子Pgla/PgpgA的控制下高效表达，得到的被孢霉工程菌株能利用自身产生的LA作为前体一步法合成CLA单一异构体，并通过高效气相色谱-质谱验证了所得产物为t10,c12-CLA。同时，为了进一步拓展关于生物催化合成共轭亚油酸的研究，本课题构建了亚油酸异构酶的酵母展示系统，将亚油酸异构酶-绿色荧光蛋白通过与锚定蛋白融合，固定化表达在酵母细胞表面。通过绿色荧光的指示作用，表明亚油酸异构酶成功表达并分泌到酵母细胞表面。以构建的工程菌株作为全细胞催化剂，在反应缓冲液中添加有4mg/ml 的亚油酸，经37℃反应20小时，检测得到t10,c12-CLA，表明酵母细胞表面展示的亚油酸异构酶具有较高的催化活性，可作为全细胞催化剂进行CLA的生产。该项目成果为实现微生物转化法规模化生产CLA奠定基础。