磷脂酶PlcP降解细菌膜脂的分子机制及其在海洋碳磷循环中的作用

In the oligotrophic marine environments, phylogenetically diverse heterotrophic bacteria can be induced to express the gene PlcP encoding-phospholipase to replace cellular phospholipids with membrane lipids devoid of P, which facilitate survival of bacteria in marine extreme conditions. Different bacteria can produce different types of PlcP. Until now, the molecular mechanism for PlcP involved in membrane lipid metabolism of marine microorganisms and the role of PlcP in marine carbon and phosphorus cycles is still unclear. This project intends to study representative members (PhPlcP, PsPlcP and DoPlcP) of three major groups of PlcP to illustrate the catalytic mechanisms of these PlcP proteins and their potential role in marine carbon and phosphorus cycles. The phospholipase activities of PhPlcP, PsPlcP and DoPlcP will be biochemically characterized. Structural analysis in combination with mutational and biochemical analysis will reveal the catalytic mechanisms of PhPlcP, PsPlcP and DoPlcP against phospholipids, respectively. To reveal the potential role of PlcP phospholipases in marine carbon and phosphorus cycles, the catalytic properties and catalytic mechanisms of PhPlcP, PsPlcP and DoPlcP will be compared, the membrane lipid composition of strains producing them will be analyzed, and the distribution and the abundace of PlcP homologs and bacterial strains producing them in marine environments will also be analyzed. Our results in this project will provide important basis for illustrating the mechanism for marine carbon and phosphorus cycles driven by marine microorganisms.

在寡营养海洋环境中，多个异养细菌类群可以诱导表达磷脂酶PlcP基因将细胞膜磷脂替换为不含磷的脂类，以降低细胞对外界有机磷的需求来适应海洋极端环境，且PlcP具有多样性。但是，PlcP参与海洋细菌膜脂代谢的分子机制及其在海洋细菌膜脂等有机碳磷循环中的作用到目前为止还不清楚。本项目拟通过选取三大类群（α-变形菌纲、γ-变形菌纲和拟杆菌纲）代表性PlcP序列研究PlcP的降解机制及其在海洋碳磷循环中的作用。首先，研究PlcP的磷脂酶活性及酶学性质，揭示不同类群PlcP的催化特性。其次，通过结构、突变和生化分析，阐明不同类群PlcP降解磷脂底物的分子机制。最后，通过比较不同类群PlcP的催化特性及机制，结合来源菌的膜脂组分等生理特征并联系菌株在海洋环境中的生态分布情况，揭示磷脂酶PlcP在海洋细菌膜脂高分子量有机碳和有机磷循环中的作用。研究结果将为阐明海洋微生物驱动碳磷元素循环的机制提供重要依据。

在寡营养海洋环境中，多个异养细菌类群被发现通过表达磷脂酶PlcP基因将细胞膜磷脂替换为不含磷的脂类，以降低细胞对外界有机磷的需求来适应海洋极端环境。到目前为止，PlcP参与海洋细菌膜脂代谢的分子机制及其在海洋细菌膜脂等有机碳磷循环中的作用还不清楚。系统发育分析表明，PlcP及其同源序列代表了一个金属磷脂酶新家族。我们选取了10个细菌类群来源的代表性PlcP序列开展研究。将这些序列在大肠杆菌中分别进行了异源表达，并通过提取膜蛋白的方法实现了PlcP疏水蛋白的纯化。生化分析表明，不同细菌类群来源的PlcP蛋白均表现为Mn2+依赖的碱性嗜热酶，能高效降解细菌膜脂主要组分磷脂酰甘油和磷脂酰乙醇胺以及磷脂酸，表明Mn2+在调控海洋细菌膜脂代谢中发挥着重要作用。结构上，来自于γ-变形菌纲的磷脂酶PsPlcP包含两个结构域，一个富含疏水残基的Lid结构域和一个催化结构域。通过结构、突变和生化分析揭示出PsPlcP结合金属离子的8个关键氨基酸残基。这些关键残基在其同源蛋白及UDP-二脂酰葡萄糖胺焦磷酸水解酶LpxH家族中非常保守，表明PsPlcP具有类似于LpxH的催化机制。但是，PsPlcP的催化腔在氨基酸残基组成及表面电荷等方面不同于LpxH，且PsPlcP的潜在底物结合残基不同于LpxH，这促成了两种酶在底物选择性上的差异。结构和突变分析还揭示出，结构域间的疏水相互作用在维持PsPlcP及其同源蛋白的热稳定性及其在有机溶剂中的稳定性中发挥重要作用，稳定了PlcP蛋白的刚性结构。通过分析宏基因组/转录组数据发现，PlcP序列在以表层海水样品为主要来源的GOS和Tara数据库以及寡营养海域马里亚纳海沟深海海水样品中均具有较高的丰度，为4.6%-18.4%，预示其在全球海洋中具有重要的生理作用。对磷脂酶PlcP的研究有助于阐明海洋微生物驱动碳磷元素循环的机制。