视网膜脱离中RIP1泛素化及去泛素化对视网膜细胞死亡/存活信号调控机制研究

本课题组前期工作中发现视网膜脱离（RD）后凋亡发生是视细胞损伤重要机制，新近研究显示凋亡与光感受器等细胞坏死样改变并存，符合坏死性凋亡特征。以此为基础，本课题拟采用特异性抑制剂干预坏死性凋亡/凋亡通路，研究RD后二者在视网膜内共存与转变规律；进而研究RIP1、RIP1去泛素化酶CYLD和泛素化酶cIAP1在视网膜细胞内表达，探讨RD时RIP1去泛素化和泛素化规律以及与坏死性凋亡/凋亡发生关系；并研究CYLD基因沉默及cIAP1过表达时，对RIP1去泛素化/泛素化以及对视网膜细胞存活和坏死性凋亡/凋亡发生的影响及调控机制。通过上述研究，将明确RD中坏死性凋亡/凋亡共存及互相转变机理，阐明RIP1泛素化和去泛素化是调控RD后视网膜细胞存活/死亡的"统一调控机制"。课题的完成对于完善RD后视网膜细胞损伤/修复分子机制，更好保护视细胞，提供新的理论依据，也为临床恢复和重建RD后视功能提供新的思路。

视网膜脱离（RD）是严重影响患者视觉功能的致盲性眼病。课题组前期研究发现，RD后光感受器细胞死亡是视功能损伤的重要因素。视网膜色素上皮（RPE）细胞是光感受器细胞存活最重要的支持细胞，RD后视网膜RPE层和光感受器细胞层分离，加剧光感受器细胞生存微稳态破坏，是导致光感受器细胞损伤/死亡的常见原因。因而明确RPE分离导致光感受器死亡的调控机制是开展视觉功能保护的理论基础。在本课题研究工作中，课题组首先采用体外培养人RPE细胞模型，发现内皮生长因子（EGF）是RPE与光感受器细胞分离后，促使RPE细胞发生迁移、增生主要刺激因子之一，且呈浓度依赖性；并且证实EGFR/PI3K/AKT通路激活是促进RPE细胞发生迁移、增生的关键信号通路。在此基础上，课题组建立大鼠RD动物模型，通过电镜观察发现RD后光感受器细胞除了发生凋亡、坏死等经典死亡形式的同时，还存在一种新的死亡形式-坏死性凋亡。进一步课题组采用泛Caspase酶抑制剂z-VAD-FMK干预，发现z-VAD-FMK在抑制RD后光感受器细胞凋亡的同时，能促进光感受器细胞坏死性凋亡增加，表明RD后光感受器细胞死亡形式存在凋亡向坏死性凋亡的转化，单独抑制凋亡并不足以保护光感受器细胞。进一步发现坏死性凋亡特异性抑制剂Necrostatin-1可以通过抑制RIP1磷酸化，进而抑制RD后光感受器细胞坏死性凋亡；同时其对于光感受器细胞凋亡并没有抑制作用。只有联合采用Z-VAD-FMK和Necrostatin-1，才能最大程度上减少RD后光感受器细胞死亡。最后，为了探讨RIP1对于RD后光感受器细胞坏死性凋亡的具体调控机制，课题组针对RIP1去泛素化酶CYLD，设计构建RNA干扰CYLD基因慢病毒载体，成功转染大鼠视网膜组织，抑制CYLD表达。并且发现RNA干扰CYLD基因能促进RIP1泛素化、抑制RIP1磷酸化，同时减少RD后光感受器细胞凋亡和坏死性凋亡。初步阐明了RIP1泛素化和去泛素化是调控RD后光感受器细胞存活/死亡的关键机制。本课题研究的完成丰富和完善了RD后光感受器细胞损伤/修复相关理论，具有一定的创新意义，为更好地保护光感受器细胞提供了新的理论依据，也为临床恢复和重建RD后视功能提供了新的治理思路。