在体、实时监测神经元分泌雌激素及相关活性物质的方法研究

建立在体、实时的神经元产生和分泌重要生物活性分子的检测方法是定量化研究情感和记忆神经环路的结构和功能的关键问题。本项目拟充分发挥项目组成员在荧光探针的设计合成和生物活性物质的原位快速检测方面的研究基础和技术优势，以神经元分泌雌激素的功能为研究对象，探索对雌激素及其相关活性物质进行原位实时传感检测和特异性取样-质谱准确定量的高效分析方法。包括（1）建立基于受体荧光探针的神经元分泌雌激素的在体、实时、高灵敏光纤荧光传感法；（2）建立基于微探头原位亲和富集-实时直接分析质谱(DART-MS)法的雌激素快速检测方法；（3）利用核酸适配体为识别元件，研究在不同刺激作用下，神经元释放雌二醇的动态观测方法；（4）利用二维液相色谱-质谱联用技术研究在不同刺激作用下，与雌激素分泌功能相关的蛋白组学变化规律。本项目的研究结果将为定量研究神经元分泌雌激素等活性物质的功能提供有力的分析检测手段。

发展在体、实时、连续观测动物脑区重要神经活性分子含量变化的分析方法对定量化研究情感和记忆的神经环路具有重要的意义。本项目成功构建了一个由微透析装置、液滴微流控芯片和荧光显微镜构成的活体在线检测平台，实现了清醒大鼠脑区神经活性物质的在体、连续、实时监测。分别研究建立了气体神经递质硫化氢和雌激素神经活性物质的实时荧光分析方法。另外，利用质谱分析方法开展了5-羟色胺缺乏的相关代谢组学研究。目前项目已正式发表SCI国际期刊论文18篇，其中11篇的影响因子在5.0以上。申请发明专利3项，其中1项已正式授权。共培养研究生8名，其中已毕业并获得博士学位3名。项目取得的突出性进展包括：（1） 成功制备了高活性的人雌激素受体蛋白配体结合域片段(hER270–595)，利用此重组受体蛋白配体结合域片段，建立了两种均相、实时检测雌激素含量变化的受体荧光传感分析方法。第一种方法利用重组受体蛋白配体结合域片段，构建了受体-香豆雌酚复合物荧光探针，实现了对雌二醇快速、灵敏的响应，最低检测限100 pg/mL，响应时间小于1 min，方法成功用于体外培养神经元分泌出的雌激素的快速检测。第二种方法是利用雌二醇与标记有雌二醇的核酸链对重组受体蛋白的竞争结合作用，同时引入了两级核酸信号放大反应，最低检出限达到10-50 pg/mL，达到生物样品中雌二醇的实时、高灵敏检测的需求。（2）设计合成了能够在高盐浓度的人工脑脊液（aCSF）中直接对硫氢根离子（HS-）产生快速响应的异硫氰基荧光素-谷胱甘肽-纳米金（AuNP-GSH-FITC）荧光探针，检测硫氢根离子的线性范围为0.1-5μM，最低检测限达到50 nM，120 s即可完成检测。进一步成功构建了由微透析装置、液滴微流控芯片和荧光显微镜构成的活体在线检测平台，实现了清醒大鼠脑区内硫化氢含量变化的在体、连续、实时监测。线性范围为5-40 μM，最低检测限2.5 μM。这是国内外首次做到活体动物内源性硫化氢变化的在体实时监测。与已有的离线分析方法相比，我们发展的在体连续检测方法可以有效防止样品处理过程带来的影响，结果更加稳定可靠，而且连续的观测可以进一步提供在不同生理条件下，活性物质的变化情况。上述活体分析检测平台具有较好的通用性，可以方便推广用于其他神经活性物质的在体实时检测。这对研究这些神经活性物质在脑活动中的功能是至关重要的。