新的致病因子- - 单核细胞源性微囊泡在糖尿病肾病中的作用机制研究

糖尿病肾病是终末期肾病主要的原因之一，而其与糖尿病状态下动脉血栓形成(atherothrombosis)密切相关，糖尿病患者体内呈现高凝状态，但传统的抗凝治疗并不能完全有效阻断血栓形成，延缓肾病进展。来自于单核细胞的微囊泡(microvesicles, MV)携带具有活性组织因子，能够促进凝血级联反应的发生，是最新发现的促凝血因子,其在糖尿病状态下血浆中总量升高，并与糖尿病肾病发生发展密切相关，有望成为临床上的糖尿病血管事件的预测因子。本项目在以往5年的工作基础上，以氧化应激为切入点，首次研究糖尿病状态下单核细胞产生微囊泡及其可能的机制，同时分离微囊泡，使之作用于肾小球系膜细胞及动物体内，并应用抗氧化剂，在体内和体外层面观察微囊泡对于肾脏的影响，以崭新角度阐述糖尿病肾病的病生理机制，对早期诊治糖尿病肾脏病变提供新的理论依据，以利于临床上探寻新的预测指标，有助于早期诊断和有效的干预。

糖尿病作为一种高凝疾病，对其并发症防治至关重要，而微囊泡最为一种新的标志物逐渐引起学者的重视。氧化应激是糖尿病并发症和微囊泡产生的共同重要机制, 因此，我们旨在研究“新的致病因子—单核细胞源性微囊泡在糖尿病肾病中的作用机制”。为此，我们成功制备了细胞模型和动物模型，建立细胞内及线粒体内ROS特异检测方法、血浆及细胞培养液微囊泡的特殊检测方法。重要发现如下：1.我们首次研究高糖及AGEs对微囊泡的影响。结果提示，高糖及AGEs可刺激THP1细胞产生具有促凝活性的微囊泡，且与THP1凋亡相关。微囊泡的产生伴随着细胞内及线粒体内ROS产生增加，应用NAC可部分抑制微囊泡生成，而线粒体特异的抑制剂却未观察到此作用，这提示，微囊泡生成与氧化应激有直接关系；高糖及AGEs能够激活MAPK传导通路，包括ERK及P38蛋白的磷酸化，但由于只有P38抑制剂能够部分减少微囊泡的产生，从而提示，P38通路参与了THP1微囊泡的生成。2.我们首次探讨微囊泡对HRMC及足细胞的影响，有利于更深入了解高糖状态下系膜细胞及足细胞损伤，进一步阐述糖尿病肾病的发病机制。一般在低氧条件下，HIF1α移位至细胞核中与1β形成异二聚体发挥调节作用，参与血管生成、细胞糖代谢、细胞增殖、细胞存活及凋亡等。我们发现，单核细胞源性微囊泡能够不同程度的增加系膜细胞及足细胞HIF1-α及VEGF的表达，包括基因水平及蛋白水平，但不是通过氧化应激方式，这从另一方面证明，微囊泡作为细胞间对话的载体，起着不可忽视的作用。单核细胞在高糖刺激下产生的微囊泡很可能携带了某种生长因子或过渡金属，铁离子螯合物，可能作为某种信号的载体，从而在常氧状态下诱导了HIF1-α及其下游VEGF的表达。3. 我们首次对实验性糖尿病肾病微囊泡的产生进行研究。通过生化指标检测及病理（光镜+电镜）结果，我们发现，糖尿病肾病大鼠其肾小球足细胞从结构到功能均变化显著，足细胞特异分子（nephrin、PCX、WT1及VEGF）的基因及蛋白表达水平均明显下降, 而应用NAC可部分逆转糖尿病肾病足细胞损伤；微囊泡伴随着肾病进展逐渐增加，并且NAC在改善足细胞损伤的同时，能够降低微囊泡的产生，为临床治疗提供新的思路。4.我们未发现来源于糖尿病肾病大鼠的微囊泡对正常肾组织形态及功能产生影响，这提示MV可能通过肾脏局部各细胞间的对话发挥作用。