基于DNA甲基化的叶酸对神经干细胞表观遗传学作用机制的研究

本研究采用体外培养大鼠胚胎海马神经干细胞（NSCs）和制备大鼠中动脉栓塞（MCAO）模型，在正常、缺乏和补充叶酸及甲基化阻断剂条件下，采用甲基化免疫共沉淀结合芯片技术高通量检测NSCs全基因组的甲基化状态，重点关注NSCs增殖分化过程中起关键作用的基因甲基化的改变，找出叶酸作用的甲基化基因；采用溴脱氧尿苷（BrdU）掺入法、免疫组化双标记及激光扫描共聚焦显微镜检测NSCs的增殖和分化，利用磁共振成像(MRI)技术追踪移植的超顺磁性氧化铁标记NSCs。采用迷宫实验观察动物模型的认知损伤。通过叶酸对MCAO大鼠内源NSCs增殖分化、外源NSCs存活迁移的影响，全面了解甲基化途径在叶酸对NSCs增殖、分化及迁移中的作用；通过体外研究，深入了解叶酸是通过改变哪些基因的甲基化状态从而影响NSCs的增殖分化，并提出可能的调控机制。为研究叶酸在中枢神经系统发育和防治神经系统相关疾病的作用提供科学依据。

为了探索基于DNA甲基化途径叶酸对神经干细胞（NSCs）增殖分化的作用机制。体外培养新生大鼠海马NSCs，采用不同剂量叶酸或五甲基四氢叶酸，DNA甲基转移酶（DNMT）阻断剂，评估DNMT在叶酸促进NSCs增殖和分化中的作用；采用甲基化免疫共沉淀结合芯片（MeDIP-chip）技术，检测体外培养NSCs在不同浓度叶酸及添加叶酸和DNMT阻断剂条件下，DNA甲基化谱的变化。结果显示，叶酸通过提高DNMT活性促进NSCs体外增殖过程，且该过程可被DNMT阻断剂减弱。同型半胱氨酸（Hcy）能够降低ERK1/2蛋白的磷酸化，抑制ERK通路，降低NSCs增殖。叶酸通过SAM、SAH的浓度改变调节DNMT活性，促进NSCs向神经元方向分化。叶酸通过改变PI3K/Akt/CREB基因的甲基化水平影响NSCs的增殖。体内研究：采用大鼠大脑中动脉栓塞（MCAO）模型，利用磁共振成像(MRI)技术追踪移植的超顺磁性氧化铁（SPIO）标记NSCs，观察叶酸补充对移植入MCAO大鼠的外源性NSCs的影响。大鼠随机分为5组：脑梗死组（MCAO）、脑梗死移植组（MCAO+NSCs）、甲基化酶抑制剂干预脑梗死移植组（MCAO+NSCs+DWI）、叶酸脑梗死移植组（MCAO+NSCs+FA）、叶酸合并甲基化酶抑制剂干预脑梗死移植组（MCAO+NSCs+DWI+FA）。结果显示，叶酸补充可使MCAO大鼠血清叶酸水平上升400-600%，使脑组织DNMT活性增高，并提高学习记忆能力。磁共振图像证明在MCAO+NSCs+FA大鼠的移植侧和缺血区域，SPIO标记的NSCs数量高于MCAO+NSCs组。免疫组化结果发现叶酸干预大鼠脑组织移植侧和缺血侧中，SOX-2/BrdU和GFAP/BrdU双标阳性细胞数量较高，甲基化酶抑制剂可影响叶酸对移植NSCs分化的作用。叶酸影响脑组织Notch信号通路相关基因表达。结论：叶酸通过提高DNMT活性促进体外NSCs增殖，并向神经元方向分化；Hcy抑制ERK通路降低NSCs增殖；叶酸通过改变PI3K/Akt/CREB基因的甲基化水平影响NSCs的增殖。叶酸可促进MCAO移植NSCs的增殖，并向星形胶质细胞分化；叶酸通过DNA甲基化途径促进MCAO移植NSCs增殖和通过Notch信号通路MCAO大鼠海马部位神经再生；补充叶酸可促进大鼠神经功能恢复，改善学习记忆能力。