运用decoy ODN策略同时干预TGF-β和Notch信号通路逆转肝纤维化进程

多种病因引起的肝损伤-炎症-修复，刺激以TGF-β为主的信号通路，进而活化肝星状细胞，使细胞外基质合成与降解失衡是肝纤维化（HF）形成的关键。研究发现Gremlin1是TGF-β的下游分子，与TGF-β的表达呈正相关，它通过拮抗BMP7，强化TGF-β信号，加速HF的形成；Hes1是Notch信号通路的下游分子，该通路与TGF-β及HF的发生发展关系密切；序列分析发现，Gremlin1与Hes1基因的启动子高度保守，具有共同调节元件，提示某些炎症相关的转录因子可能共同调节它们的表达并促进了HF的发展。本项目旨在筛选、确认并优化可以同时抑制Gremlin1和Hes1基因表达的decoy ODN，通过decoy ODN 技术阻止TGF-β和Notch信号转导以达到阻止甚至逆转HF病理进程的目的，为抗HF的分子靶向治疗提供新思路。

在纤维化的发生发展过程中，伴随着SMAD3、SP1等与肝纤维化呈正相关转录因子的活性增强，运用Decoy ODN技术竞争性地俘获这些转录因子，阻断其与靶基因启动子上的转录因子结合位点结合，从而抑制肝星状细胞（HSC）活化，是治疗肝纤维化的策略之一。本课题的研究目的主要是筛选并确认抑制肝纤维化相关基因表达的Decoy ODN，并采用相应的组合以增强其抑制HSC活化的能力。本研究通过两组系统性的实验解决了该科学问题。首先，在原代HSC水平，确认了随着HSC活化，Notch1和Hes1的表达逐渐降低。在HSC-T6水平证实，NICD1抑制肝纤维化分子的表达，而Hes1却能促进肝纤维化分子的表达，并探讨TGF-β/BMP信号对Notch靶基因Hes1表达的调控作用。采用Hes1- Decoy ODN阻断Hes1的功能时，能够抑制HSC-T6中肝纤维化标记分子α-SMA、collagen1α2的启动子表达。其次，选择与肝纤维化基因密切相关的增强子和启动子，构建相应的荧光素酶报告基因表达质粒（pGLuc-TRE-MiniTK、GLuc-pSMA、GLuc-P-COL1α2和GLuc-P-TIMP1）作为筛选平台，筛选出SP1 Decoy ODN、SMAD Decoy ODN、STAT3 Decoy ODN、Snail Decoy ODN、UTE1 Decoy ODN、Elk1 Decoy ODN具备抑制HSC活化的潜能。在此基础上，将SP1 Decoy ODN与其它五个Decoy ODN联合应用，结果显示，联合应用SP1和Elk1 Decoy ODNs能下调HSC-T6中ColⅠα2和α-SMA的表达；联合应用SP1和 UTE1 Decoy ODNs通过靶向下调TIMP1抑制HSC的活化和增殖。因此我们认为，Hes1- Decoy ODN、SP1 Decoy ODN联合Elk1 Decoy ODN、SP1 Decoy ODN联合UTE1 Decoy ODN等片段能抑制HSC的活化，这几个Decoy ODN片段有可能成为抗肝纤维化的新的分子靶点。