LPS通过影响miR-124/AhR表达介导肠上皮细胞炎性趋化因子产生在克罗恩病形成中的分子机制

Intestinal bacteria as an initiating factor may be related to intestinal immune injury ，but currently, the mechanism is not clear. Our previous study found that: lipopolysaccharide (LPS) induced high expression of miR-124 in intestinal epithelial cells (Caco-2 cells), and decreased AhR protein level. The level of miR-124 increased and AhR protein level decreased in inflamed intestinal tissues in Crohn's disease (CD) patients, miR-124 and AhR protein expressions existed inverse relationship. We propose that LPS induced miR-124, miR-124 regulating AhR expression and mediated inflammatory chemokine production in intestinal epithelial cells, finally intestinal inflammation formated. This project aims to use lentiviral vector, quantitative PCR, reporter gene assay to obtain the evidences: LPS induced miR-124 and reduced the expression of AhR protein in intestinal epithelial cells, and AhR regulated the expression of Myd88, mediated inflammatory chemokine production, eventually leading to intestinal damage, the formation of CD. This helps to clarify the molecular mechanism of LPS/miR-124/AhR/Myd88pathway in CD pathogenesis, and provide a potiential target for the treatment of CD.

肠内微生物可能是促发肠道免疫损伤形成的始动因素，目前机制尚不明确。我们前期研究发现：细菌脂多糖（LPS）刺激肠上皮样细胞（Caco-2 细胞）miR-124升高， AhR蛋白减低。克罗恩病（CD）患者病变肠组织miR-124升高而AhR蛋白减低，miR-124与AhR 蛋白表达呈“翘板”改变。我们提出LPS诱导miR-124，miR-124靶向调控肠上皮细胞AhR表达，介导炎性趋化因子产生增加，导致肠道炎症形成的假说。本课题拟利用慢病毒载体构建，定量PCR测定、报告基因实验等手段，获得：LPS升高肠上皮细胞miR-124，减低AhR蛋白表达， AhR继而调控Myd88表达，介导炎性趋化因子产生，最终导致肠道损伤，CD形成的证据。证实miR-124靶向抑制AhR表达，而AhR调控Myd88通路介导肠上皮细胞炎性趋化因子产生，克罗恩病形成的分子机制，为寻找治疗新靶标提供依据。

研究背景及目的：根据国内外目前研究结果，比较公认克罗恩病的发生与遗传、肠道微环境、免疫因素有关，但不管何种原因，最终都会导致肠道黏膜免疫异常反应，肠道黏膜免疫反应异常所导致的炎性反应在CD发病中起重要作用，而肠上皮黏膜屏障受损是肠道免疫失衡进而启动CD肠道炎症的关键因素。国内外很多文献证实，lncRNA参与自身免疫性疾病的持续炎症反应，而lncRNA是否参与自身免疫性肠炎克罗恩病（CD）的发生研究甚少。本研究从肠粘膜组织中筛选出差异表达lncRNA出发，证明该基因在CD发生和发展中起的关键作用，为CD的治疗提供新的靶点。研究内容：本研究在临床水平通过基因高通量测序技术及扩大样本组织验证明确克罗恩病患者肠组织中lncRNACNN3-206表达差异，通过生信分析技术及FISH实验初步建立lncRNACNN3-206-miR-212-Caspase10基因表达调控网,在细胞水平，阐明lncRNACNN3-206对靶基因Caspase10调控的具体分子机制及对细胞功能的影响；最后在动物水平，通过干预lncRNA的水平，观察模型动物生理状态、结肠病理损伤程度、相关免疫细胞比例等是否有明显改善。研究结果：lncRNACNN3-206在CD患者病变肠粘膜组织中表达明显高于正常肠粘膜组织。通过lncRNACNN3-206-miR-212-Caspase10基因表达调控网来介导肠上皮细胞的凋亡加速、自噬、侵袭迁移能力增强，从而导致肠粘膜屏障的破坏和肠上皮细胞游走性增强，穿透肠粘膜层到达固有肌层甚至浆膜层，引起瘢痕形成透壁性瘢炎症。动物CD模型内干扰该基因表达可减轻肠粘膜炎症、促进肠粘膜修复。研究结论：CD患者病变肠粘膜组织和健康体检者正常组织中lncRNA的种类和含量存在明显差异，说明病变组织中差异表达的lncRNA在肠粘膜炎症进展中发挥重要作用。lncRNACNN3-206通过lncRNACNN3-206-miR-212-Caspase10基因调控网激发肠上皮细胞的凋亡、迁移、自噬的生物学行为，对诱发CD发病和维持疾病的持续发展起着关键作用。因此lncRNACNN3-206完全可以作为研究CD治疗方案的新靶点，为人类基因治疗CD提供新的思路和研究方向。