金钗石斛转录组分析及石斛碱代谢相关基因的功能验证

The production of Dendrobium nobile Lind1．in Chishui account 70% of the total. In practice, the content of Dendrobine are different greatly in different ecological environment, different growth, different year and different harvest time. The content of Dendrobine of different growth stage are significant difference, too. In order to ensure orderly in development of Dendrobium nobile Lind1．and obtain the stable and controllable content of Dendrobine, how to produce, operate, accumulate and culture, these urgent to solve the Dendrobine metabolism mechanisms. The metabolic pathways of is not known, so the research on metabolic regulation are little. At present, the internationally recognized method of research metabolic pathways is High-throughput transcriptome sequencing technology,which is direct,quick,correct and effective. Consequently, the growth period of Dendrobium nobile Lind1．as experimental material, the transcriptome and digital gene expression profiling analyses of Dendrobium nobile will be conducted during the Dendrobine using the RNA-Seq technology. All of the transcript information of will be revealed. The number, function and expression pattern of differentially-expressed genes (DEGs) will be analyzed and compared, systematically screened Dendrobine-related genes. The relationship between the DEGs and its corresponding Dendrobine metabolism will be ascertained for Dendrobium nobile.

赤水金钗石斛产量占全国70%，而生产中发现不同生态环境、不同长势、不同生长年限、不同采收期金钗石斛商品中石斛碱含量差异大，研究还发现不同生育阶段金钗石斛茎中石斛碱含量差异显著，为保证赤水金钗石斛产业的发展，金钗石斛碱含量的稳定可控，了解石斛碱在植株体内如何产生、运转、积累，如何调控栽培措施，都迫切需要了解金钗石斛碱的代谢机制。而石斛碱代谢途径不清楚，导致石斛碱代谢调控研究甚少。目前国际公认的研究代谢途径最直接、快速、准确、有效的方法是高通量转录组测序技术，为此，本项目以各生育期金钗石斛为试验材料，应用RNA-Seq技术构建金钗石斛转录组和数字基因表达谱文库，全面揭示金钗石斛转录本信息，分析比较差异表达基因的数量、功能和表达模式，系统筛选参与石斛碱代谢相关基因，并通过实时荧光定量PCR技术进行验证，再结合基因功能进一步验证，揭示石斛碱代谢相关基因表达与石斛碱代谢的关系。

本项目以各生育期金钗石斛为试验材料，研究金钗石斛干物质积累与分配规律、石斛碱积累与分配特性，发现石斛碱含量与金钗石斛的不同发育阶段有关，为此，以石斛碱含量存在显著差异的4个时期金钗石斛茎为样本，进行数字基因表达谱测序，同时构建金钗石斛转录组文库，对4个时期金钗石斛茎差异表达基因进行分析。.通过构建金钗石斛转录组文库，获得79,436个Unigene，平均长度是780nt，有55,393条Unigene被注释到Nr，Nt，SwissPort，KEGG，COG，GO六个公共数据库，占总Unigene的69.73%。有30,061个Unigene序列被注释到128条KEGG代谢途径，代谢通路分析显示，有426条基因参与萜类化合物骨架生物合成（ko00900）路径，有28条基因参与倍半萜和三萜类化合物的生物合成（ko00909）路径。.构建了石斛碱含量具有显著差异的4个时期数字基因表达谱文库，以金钗石斛转录组序列为参考基因组，对表达谱文库进行分析。6月和10月、9月、8月间DEG数量分别是2482、2332和1487个，均表现下调基因大于上调基因；8月与9月、10月，9月与10月间DEG数量分别是1361，1614和1619个，均表现上调基因大于下调基因。综合4个DGE代谢路径富集分析显示17条基因参与了萜类化合物骨架生物合成路径，2条参与了倍半萜和三萜类化合物的生物合成路径。.筛选了5个参与石斛碱代谢途径的关键酶基因，分别是甲羟戊酸激酶基因（Unigene1219），赖氨酸甲基化酶基因（CL429），异戊烯二磷酸异构酶基因（CL3435），法尼基转移酶基因（CL11407）和半胱氨酸甲基酯酶基因（CL8067），通过实时荧光定量PCR定量表达对RNA-Seq差异表达基因的表达量进行验证，发现两种方法测定的DEG表达变化相似，相关性达到极显著水平。.石斛碱生物合成途径先按照萜类化合物形成的共同途径至单萜（萜类形成的共同前体途径即甲羟戊酸（MVA）途径和2-C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸（MEP）途径），再按照倍半萜途径进行生物合成。本研究结果为石斛碱生物合成路径的研究指明了方向，并为其它萜类生物碱研究及金钗石斛中其它次生代谢物研究提供了平台。