O-GlcNAc糖基转移酶OGT在MOF/NSL组蛋白乙酰基转移酶复合物中的结构和作用研究

OGT plays an important role in the regulation of a variety of biological processes by O-GlcNAc glycosylation to serine/threonine residues of intracellular proteins in cells. With deglycosylation enzyme OGA together maintains O-GlcNAc glycosylation homeostasis. Accumulating data indicate that the increased enzymatic activities of OGT led to O-GlcNAc modification on many oncogenes in a variety of cancers. Most recent studies confirm that the glycosylation of OGT as a protein-coding might provide recognition mark for subsequent molecular or instruction for subsequent biological processes. However, the detail mechanism is unclear. Recently, we purified and characterized hMOF-containing histone acetyltransferase NSL complex. It is worth noting that OGT is one of the components of this complex. Our preliminary data showed that OGT can direct bind to NSL3, a subunit of NSL complex, and can glycosylate the C-terminus of NSL3, suggesting that OGT might be involved in the regulation of acetylation activity of NSL complex. In this proposed study, using in vivo and in vitro experimental aproaches together with mass spectrometry and DNA chip technologies, we will elucidate the structural relationship between OGT and other subunits of the NSL complex. Moreover, we will clarify the glycosylation patterns of OGT on the acetyltransferase activity and biological functions of the NSL complexes.

OGT以细胞内蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基为底物，通过O-GlcNAc修饰来调控细胞内一系列重要的生物学过程，并与去糖基化酶OGA 共同维持O-GlcNAc修饰的动态平衡。在癌症时已经发现许多致癌因子被O-GlcNAc修饰。另外，研究证实O-GlcNAc修饰可能为后续蛋白执行下一个生物过程提供了识别标志，但是，其作用机制尚不清楚。最近，我们纯化和鉴定了人源NSL组蛋白乙酰基转移酶复合物，而OGT是此复合物的亚基组分之一。我们在预实验中证实OGT可以与另一亚基NSL3直接结合，并糖基化NSL3的C端，提示OGT可能参与调节NSL复合物的乙酰基化酶活性。本项目拟通过体内/外实验方法，结合基因敲低或过表达、蛋白质谱检测和DNA芯片等技术，系统研究OGT在NSL复合物中与其它亚基蛋白间的结构关系，明确OGT在NSL复合物中的糖基化模式及其对NSL复合物的乙酰基转移酶活性和生物学活性的影响。

OGT（O-linked N-acetylglucosamine (O-GlcNAc) transferas）以细胞内蛋白质丝氨酸/苏氨酸残基为底物，通过O-GlcNAc修饰来调控细胞内的一系列重要的生物学过程，并与去糖基化酶OGA共同维持O-GlcNAc修饰的动态平衡。在癌症时 已经发现许多致癌因子被O-GlcNAc修饰。另外，研究证实O-GlcNAc修饰可能为后续蛋白执行下一个生物过程提供了识别标志，但是，其作用机制尚不清楚。利用构建稳定表达细胞系并结合体外酶活性检测，我们纯化和鉴定了人源含MOF的NSL组蛋白乙酰基转移酶复合物，而OGT1是此复合物的亚基组分之一。进一步研究发现OGT1可以和NSL复合物中的亚基NSL3（nonspecific lethal protein 3）直接结合，并通过OGT1 / O-GlcNAcylation介导的NSL3稳定性调节全细胞组蛋白H4的乙酰化水平。在本项目中，我们利用系统生物化学和分子生物学实验技术，证明了在NSL3蛋白C-端第Thr755位点的O-GlcNAc糖基化修饰与MOF/NSL复合物的全酶活性密切相关。首先，通过体外O-GlcNAc-转移酶活性检测结合蛋白质谱分析，我们推断NSL3蛋白C-端的第Thr755残基是被O-GlcNAc修饰的主要位点；其次，OGT1对该位点的O-GlcNAc修饰调控NSL3蛋白的泛素化降解途径，因为该位点突变（T755A）促进了NSL3蛋白的泛素降解。更有趣的是，我们发现泛素结合酶UBE2S可以与NSL3直接结合并加速NSL3的降解。进一步研究还发现，OGT1和UBE2S竞争性地与NSL3结合，提示OGT1-UBE2S协同调节NSL3在细胞内的稳定性。此外，NSL3第755位苏氨酸O-GlcNAc糖基化修饰在维持NSL复合物的结构稳定性和全酶活性中发挥重要的作用。最后，通过集落形成实验，我们证实NSL3 Thr755位点的O-GlcNAc糖基化修饰介导的MOF/NSL复合物的完整性和全酶活性影响II型肺癌上皮样A549细胞的增殖。综上所述，我们的研究结果为阐明MOF / NSL复合物的分子机理提供了实验依据。