苹果受体类蛋白激酶MdCERK1与MdPR4互作调控砧木再植病抗性的分子机制研究

It is of great importance for enhancing the precision of replanting control and shortening the breeding cycle to carry out research on apple rootstocks about ARD-resistant gene screening and signal pathway clarification. Our previous results have shown that MdCERK1 and MdPR4 can response to ARD pathogen inoculation and interact with each other. On this basis, Y2H will be used to identify the exact domains involved in the interaction. Meanwhile, how chitin affects the interaction intensity will be examined by LUC/REN. Additionally, MdPR4’s chitin binding ability will be verified by chitin affinity assay. To clarify MdCERK1’s function in ARD resistance, phenotypes and downstream genes’ expression levels will be compared after inoculating MdCERK1’s knock out and overexpression transgenic lines with ARD major fungal pathogens. Finally, through chitin treatment on MdCERK1 (-) × MdPR4 (+) bi-transgenic apple callus, downstream genes’ expression levels will be tested to define their transduction mechanism for chitin signal. Collectively, these findings will reveal the molecular mechanism of how MdCERK1 and MdPR4 interact with each other to regulate ARD resistance. Moreover, the transgenic rootstocks obtained from this project will lay a foundation for control methods development and resistant varieties breeding.

开展苹果砧木再植病抗性基因筛选及信号路径解析，对提高再植病防治的准确性、缩短育种周期均具有重要意义。项目组前期研究成果表明，苹果的MdCERK1和MdPR4基因能响应再植病病原菌侵染，且两者在该植病体系中存在互作关系。在此基础上，本项目拟通过Y2H技术对两者的互作结构域进行鉴定；利用LUC/REN技术验证几丁质对两者互作强度的影响；通过几丁质亲和性实验鉴定MdPR4的几丁质绑定能力；通过对MdCERK1沉默和过表达的转基因苹果接种再植病主要致病真菌后，观察表型和检测下游基因表达水平，明确MdCERK1的抗病功能；通过对共转MdCERK1（-）× MdPR4（+）的苹果愈伤进行几丁质处理，检测下游基因表达量，明确两者对几丁质信号的转导机制。综合上述多方面的证据，解析苹果MdCERK1通过与MdPR4互作调控再植病抗性的分子机理，获得的转基因砧木品种，也将为防治方法开发和抗性品种培育奠定基础。

苹果再植病是一个复杂又难以解决的历史性问题，从最早有相关再植病的记载至今，已有超过200年的历史。苹果作为世界范围内最重要的果树之一，所有主要的苹果产区都有对苹果再植病发病的记录和报导。苹果再植病对果园产量的影响十分持久，发病果园结果晚、产量低。我国是苹果生产大国，栽培面积和产量均居世界第一。然而，我国有将近70%的果园建园已经超过20年，每年约有超过1.4万公顷的果园需要更新，苹果再植病害已经成为制约我国苹果持续健康发展的最主要问题之一。开展苹果砧木再植病抗性基因筛选及信号路径解析，对提高再植病防治的准确性、缩短育种周期具有重要意义。本项目在前期挖掘到苹果MdCERK1 基因和其在苹果再植病植病体系中的互作蛋白MdPR4的基础上，通过酵母双杂交、pull-down、LUC/REN 、苹果遗传转化等技术对两者互作模式及通过互作调控再植病抗性的分子机理进行了深入研究，获得了以下主要的研究结果：1. 通过几丁质亲和性和几丁质响应证明了MdCERK1和MdPR4均通过直接的几丁质绑定来对几丁质进行响应；2. 通过pull down、酵母双杂及亚细胞定位，证明了MdCERK1通过N端的LysM结构域与MdPR4在细胞膜上发生互作；3. 通过对共转MdCERK1 x MdPR4的苹果愈伤进行几丁质处理，进行双荧光素酶发光检测，明确了两者的互作强度受几丁质影响；4. 通过农杆菌介导的苹果遗传转化，获得了过表达MdCERK1的抗性种质。通过本项目的开展，项目组解析了苹果MdCERK1通过与MdPR4互作调控再植病抗性的分子机理，获得转基因的砧木品种，为防治方法开发和抗性品种培育奠定基础。