BMP-4诱导大鼠肝卵圆细胞向肝细胞分化的细胞信号传导及其下游调控靶基因的分子机理研究

肝卵圆细胞（HOC）向肝细胞分化是肝再生的重要途径，我们发现肝星状细胞（HSC）激活后分泌的BMP-4可诱导HOC向肝细胞定向分化，但它在HOC的细胞信号传导通路及下游调控靶基因尚不明确。本项目拟检测Smad1/5/8、ERK、JNK、p38、C/EBPs等因子在大鼠HOC中的基因表达、蛋白磷酸化及其向核内转移和聚集情况，明确BMP-4在HOC的细胞信号传导机制。运用荧光差异显示双向凝胶电泳、质谱分析和微量蛋白质N末端测序技术，筛选BMP-4在HOC所调控的下游靶基因。并利用基因过表达和shRNA沉默技术，反向验证BMP-4在HOC的细胞信号传导通路及其所分别调控的下游靶基因的特异性。研究成果将有助于了解BMP-4诱导HOC向肝细胞定向分化的分子机理，从理论上完整地解释肝损伤早期HSC激活有助于肝修复的重要科学现象，为利用HOC移植及分化诱导治疗肝损伤或可能的后续肝癌发生机理研究奠定基础。

肝卵圆细胞（HOCs）向肝细胞分化是肝再生的重要途径，我们发现肝星状细胞（HSCs）激活后分泌的骨形态发生蛋白-4（BMP-4）可诱导HOC向肝细胞定向分化，但它在HOCs的细胞信号传导通路及下游调控靶基因尚不明确。. 本研究采用二乙酰氨基芴（2-AAF）喂养+2/3肝切除法诱导大鼠HOCs增殖，以肝脏原位灌注法消化大鼠肝组织，梯度离心分离高纯度大鼠原代HOCs。运用实时荧光定量RT-PCR（Real-time RT-PCR）、Western杂交、细胞免疫荧光等技术，检测发现BMP-4可通过Smad1/5/8、ERK、JNK、p38、C/EBP-a 和C/EBP-β等细胞转录因子，传导细胞调控信号，诱导HOCs向成熟肝细胞定向分化。. 通过构建特异性BMP-4和短发夹结构BMP-4 shRNA的慢病毒载体，并分别转染大鼠原代HOCs，建立大鼠HOCs细胞蛋白的差异显示双向凝胶电泳图谱，经图谱比较分析，寻找差异表达的蛋白质点，再采用MALDI-TOF-MS质谱分析并结合生物信息学方法鉴定BMP-4下游差异表达的蛋白质，然后以Real-time RT-PCR和Western杂交技术反向验证，证实BMP-4在大鼠HOCs通过其细胞信号传导通路，调控BTB/POZ domain-containing protein 7 (BTBD7)、Rac1和WAVE2等下游靶基因，实现对HOCs向成熟肝细胞定向分化的诱导作用。. 我们进一步采用体外和体内细胞增殖、侵袭转移、分化、血管生成、细胞周期与凋亡、回顾与前瞻性临床大样本分析等手段，通过对肝癌细胞、肝癌转移裸鼠模型、516例肝癌组织标本的检测，发现BMP-4的下游调控的上皮间质转化（EMT）相关蛋白BTBD7，可以通过激活RhoC-Rock2-FAK细胞信号传导通路，增强肝癌组织微血管生成与上皮间质转化，促进肝癌的侵袭转移。. 本项目研究成果进一步明确了BMP-4诱导HOCs向肝细胞定向分化的分子机理，从理论上解释了肝损伤早期HSCs激活有助于肝修复的重要科学现象，为利用HOCs移植及分化诱导治疗肝损伤，以及调控BMP-4下游分子BTBD7改善肝癌患者预后提供了新的线索与实验依据。